Dokument: Charakterisierung des neuen äußeren Kinetochorsubkomplexes Spc7-Sos7 in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe
| Titel: | Charakterisierung des neuen äußeren Kinetochorsubkomplexes Spc7-Sos7 in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18657 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110712-112328-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Jakopec, Visnja [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Fleig, Ursula [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Eine der frühsten zytologischen Untersuchungen eukaryotischer Zellen durch Walther Flemming im Jahre 1882 identifizierte eine Region auf jedem Chromosom, die für die präzise Verteilung des Chromatins essentiell ist. Heute weiß man, dass in dieser spezifischen DNA-Region eine Protein-Maschinerie assembliert, die als Kinetochor bezeichnet wird. Der Kinetochorkomplex ist zirka 5 MDa groß und besteht aus bis zu 100 Proteinen, die in mehreren, teilweise hoch konservierten Subkomplexen organisiert sind. Fast 140 Jahre nach Flemming`s Arbeiten ist die genaue Wirkungsweise der einzelnen Subkomplexe dieses zentralen Regulators der Mitose immer noch nicht verstanden und, wie meine Arbeit zeigt, sind immer noch nicht alle essentiellen Komponenten dieser Protein-Maschinerie identifiziert.
Der korrekte Ablauf der Mitose wird durch den Kinetochorkomplex dirigiert und resultiert in der genauen Verteilung der duplizierten Chromosomen auf die beiden Folgezellen. Fehler in diesem Prozess führen zu Aneuploidie, dem Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen. Aneuploide Zellen sind meist nicht lebensfähig oder führen zu Abnormitäten. So wird Aneuploidie mit einer Vielzahl von Tumorarten, neurodegenerativen Krankheiten und auch der Zell- und Organismus-Alterung in Verbindung gebracht. Die Kinetochorsubkomplexe können in DNA interagierende und mit dem Spindel-Apparat interagierende Proteine unterteilt werden. In unserer Modellhefe, der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, ist der Sim4-Kinetochorsubkomplex mit dem Zentromerchromatin assoziiert, während der evolutionär hoch konservierte NMS (Ndc80 Komplex/MIND-Komplex/Spc7) Kinetochorsubkomplex essentiell für die Kinetochor-Spindelmikrotubuli-Verknüpfung ist. Diese Arbeit befasst sich mit der Funktionsweise der NMS-Komponente Spc7, die mit 153,5 kDa das größte S. pombe Kinetochorprotein darstellt. Meine zellbiologischen und genetischen Analysen zeigen, dass Spc7 ein Verbindungsglied zum separat existierenden Sim4 Komplex bildet und dass Spc7 zusammen mit dem MIND-Komplex eine Untereinheit des NMS-Komplexes darstellt. Der C-terminale Teil des Spc7 Proteins bindet an den Kinetochorkopmlex, während der N-terminale Teil direkt mit Mikrotubuli-assoziiert. Mit der Generierung und Analyse von 36 unterschiedlich großen Spc7 Proteinfragmenten konnten die Kinetochor-Bindedomäne auf 175 Aminosäuren eingegrenzt und drei potentielle Mikrotubuli-bindende Domänen identifiziert werden. Außerdem wurden die NLS- und NES-Sequenzen dieses Proteins identifiziert. Die Generierung der unterschiedlichen Spc7 Konstrukte in S. pombe Plasmiden wurde mit einer von mir entwickelten in vivo Klonierungsmethode durchgeführt. Neben seiner Funktion am Kinetochor reguliert der C-Terminus von Spc7 auch die Formation und Integrität der bipolaren Spindel. Die Expression einer dominant negativen Spc7 Variante in S. pombe führt zu massiven Spindeldefekten in allen 3 mitotischen Spindelstadien. Mit Hilfe einer hoch saturierten extragenen Multikopien-Suppressoranalyse einer spc7 Mutante konnte ich mehrere neue Interaktionspartner dieser Kinetochorkomponente identifizieren. Ich habe die Funktion von 3 dieser Proteine, nämlich Btf3, Mpd2 und Sos7 charakterisiert, wobei mein Hauptaugenmerk auf der Analyse des Sos7 Proteins lag. Mit Sos7 gelang die Identifikation einer bis dato nicht bekannten, hoch konservierten Familie von Kinetochorproteinen. Sos7 ist eine essentielle neue Komponente des NMS-Komplexes, die über ihr C-terminales Ende direkt mit Spc7 interagiert. Durch Generierung und Analyse von konditional-letalen sos7 Mutanten konnte eine essentielle Rolle von Sos7 bei der Chromosomensegregation, der Verknüpfung der antiparallelen Mikrotubuli der bipolaren Spindel sowie beim Aufbau des MIND-Spc7-Sos7 Subkomplexes definiert werden. Eine Datenbank-Analyse identifizierte eine Reihe von Sos7-ähnlichen Proteinen in Pilzen. Keines dieser Proteinen wurde bis dato charakterisiert, allerdings zeigt meine Analyse des Sos7 homologen Proteins aus S. japonicus, dass Sos7 eine neue Familie von Kinetochorproteinen definiert. Interessanterweise kommen Sos7 Homologe nicht in Mitgliedern der Familie der Saccharomycetaceae vor, die im Gegensatz zu den übrigen Pilzen und höheren Eukaryoten ein Punktzentromer tragen. Somit kann die evolutionäre Weiterentwicklung des Zentromers erstmals anhand einer Proteinfamilie dokumentiert werden.One of the earliest cytological analyses of eukaryotic cells conducted by Walther Flemming in 1882 revealed on every chromosome a region that is essential for precise chromatin segregation. Today it is known that on this specific chromatin-region a huge protein machinery, the kinetochore, assembles. The kinetochore complex has a molecular mass of approximately 5 MDa and contains up to 100 proteins. These proteins are organized into different protein subcomplexes some of which show evolutionary conservation. Nearly 140 years after Flemming`s discovery the specific function of some subcomplexes is still poorly understood. Indeed as shown by my work, not all components of this broad protein machinery have been identified. The kinetochore complex orchestrates mitosis which results in the accurate segregation of the duplicated chromosomes to the two daughter cells. Defects in this process lead to aneuploidy i. e. the loss or gain of whole chromosomes. In most cases aneuploid cells are not viable or can lead to severe abnormalities. Thus a connection exists between aneuploidy, cancer, neurodegenerative diseases and ageing. The kinetochore subcomplexes can be divided roughly into the chromatin and spindle interacting components. In our model organism, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the Sim4 kinetochore complex is associated with the centromere chromatin while the evolutionary conserved NMS (Ndc80 complex/MIND-complex/Spc7) kinetochore subcomplex is essential for the kinetochore-spindle-microtubule connection. In this work I have analyzed the function of the NMS network component Spc7, the largest kinetochore protein in S. pombe of 153.5 kDa size. My cell biological and genetic analyses revealed a role for Spc7 as a connecting element to the separate Sim4 complex and uncovered that Spc7 together with the MIND complex forms a subunit of the NMS network. The C-terminus of Spc7 is kinetochore connected while the N-terminus associates with microtubules. With the generation and analysis of 36 different Spc7 fragments I mapped the kinetochore binding domain to a 175 amino acid region and identified three putative microtubule binding sites. To generate the different Spc7 constructs I developed an in vivo cloning system in S. cerevisiae. Apart from its function at the kinetochore the C- terminus of Spc7 is also required for the formation and integrity of the bipolar spindle. The expression of a dominant negative Spc7 variant in S. pombe leads to massive defects in all of the three mitotic spindle stages. With a highly saturated multicopy suppressor screen of a spc7 mutant I isolated several new interaction partners of this kinetochore component. I characterized 3 of these proteins, namely Btf3, Mpd2 and in great detail Sos7. Sos7 is an essential new component of the NMS network and interacts via its C-terminus with Spc7. With the generation and analysis of conditional lethal sos7 mutants, I discovered an essential role for Sos7 in chromosome segregation, the connection of antiparallel microtubules of the bipolar spindle and the assembly of the MIND-Spc7-Sos7 subcomplex. A data base search identified many Sos7-like proteins. None of them has been characterized but my analysis of the S. japonicus Sos7 homologue revealed a new family of kinetochore proteins. Interestingly the family of Saccharomycetaceae which carries in contrast to other fungi and higher eukaryotes a point-centromere, harbors no Sos7 homologue. Therefore the evolutionary developments of kinetochore complexes can be documented using this protein family. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen | |||||||
| Dokument erstellt am: | 12.07.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.07.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.04.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.06.2011 |
