Dokument: HCV interferiert mit Ack1-abhängigen Signalwegen durch Herabregulation der TC-PTP

Titel:	HCV interferiert mit Ack1-abhängigen Signalwegen durch Herabregulation der TC-PTP
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18639
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110713-101937-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. biol. Cebula, Patricia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,39 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.07.2011 / geändert 11.07.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Bode, Johannes [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Hepatitis C-Virusinfektion stellt heute ein globales Problem dar, da etwa 170 Millionen Menschen als chronisch infiziert gelten. Vor allem die in den letzten Jahren unternommenen experimentellen Anstrengungen führten zu der Annahme, dass HCV mit einer Vielzahl von wirtseigenen Proteinen interferiert und folglich Strategien entwickelt haben muss, um die antivirale Immunantwort zu umgehen. Hierbei ist insbesondere das nichtstrukturelle Protein NS3/4A von Interesse. So konnte belegt werden, dass der NS3/4A-Komplex durch die proteolytische Spaltung von CARDIF und TRIF essentielle Komponenten der angeborenen, antiviralen Immunantwort der Wirtszelle blockiert. Zudem interagiert HCV NS3/4A durch die proteolytische Spaltung der TC-PTP mit dem Liganden-induzierten EGFR-Signalweg und verstärkt damit die Aktivierung nachgeschalteter Signalwege. Daraus resultierend wird für das NS3/4A-Protein eine Modulation der Zellproliferation und Apoptoseregulation diskutiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden Zelllinien, die HCV Core und NS3/4A stabil exprimieren, retroviral generiert sowie biochemisch und immunzytochemisch charakterisiert. Parallel zu der Etablierung des Zellkultursystems wurde eine Targeting-Strategie zur Generierung einer konditionalen, für HCV NS3/4A transgenen Maus erstellt und der Rekombinationsvektor kloniert. So soll nachfolgend eine Mauslinie mittels des Cre/loxP-Rekombinationssystems generiert werden, die eine zeit- und leberspezifische Expression des HCV NS3/4A-Gens und weitere in vivo Analysen ermöglicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Rezeptor-vermittelten Apoptose belegt, dass die Stimulation mit TNF-α alleine nicht, in Kombination mit dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D jedoch zur Apoptoseinduktion führt, die durch die proteolytische Spaltung der Caspase-3 und PARP nachgewiesen wurde. In weiterführenden Experimenten konnte allerdings keine Beeinflussung der Apoptoseinduktion durch die Präsenz von HCV Proteinen festgestellt werden. Die Untersuchung der Aktivierung des anti-apoptotischen Transkriptionsfaktors STAT3 führte in der Western Blot-Analyse zur Detektion eines distinkten Bandenmusters in Folge einer Kreuzreaktion mit dem Phosphotyrosin-spezifischen Antikörper (Tyr705). Mittels Koimmunopräzipitation konnte die Spezifizität der Kreuzreaktion bestätigt werden. Das unbekannte Protein wurde in Gegenwart von HCV Proteinen im konstitutiv phosphorylierten Zustand nachgewiesen. Eine Datenbanksuche identifizierte die Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase Ack1 als putativen Kandidaten. Die im dritten und letzten Teil der Arbeit vorgestellten Daten identifizieren Ack1 als Protein, welches in HCV Proteine enthaltenden Zellen konstitutiv am Tyrosinrest 857/858 phosphoryliert vorliegt. Die Tyrosinmotive sind in der EGFR-bindenden Domäne von Ack1 lokalisiert. Durch den Einsatz von siRNA konnte TC-PTP als diejenige zelluläre Tyrosin-Phosphatase identifiziert werden, welche direkt oder indirekt die Phosphorylierung von Ack1 an den Tyrosinmotiven 857/858 negativ reguliert. Die Phosphorylierung von Ack1 ist unabhängig von der EGFR-Aktivität und übt keinen Einfluss auf die Kinetik der EGFR-Internalisierung nach Ligandenbindung aus. Der Einsatz Ack1-spezifischer siRNA legt nahe, dass Ack1 für die Replikation von HCV nicht essentiell ist. Einen Hinweis auf die Beteiligung von Ack1 beim Viruseintritt liefert die Beobachtung, dass Zellen, die das subgenomische HCV-Replikon exprimieren, aber auch Zellen, die HCV NS3/4A exprimieren, einen erhöhten Proteinlevel von Cdc42 aufweisen. Da Ack1 als Target von Cdc42 fungiert, besteht hier möglicherweise ein Zusammenhang zwischen der Hochregulation von Cdc42 und der konstitutiven Phosphorylierung von Ack1. Western Blot-Analysen verdeutlichten einen erniedrigten Ack1-Proteinlevel in Zelllinien, die das subgenomische HCV Replikon exprimieren, nicht aber in Zellen, die HCV NS3/4A-Proteine beherbergen. Möglicherweise ist hierfür der in Huh 9-13-Zellen erhöhte Proteinlevel der Ack1-ubiquitinylierenden E3 Ubiquitin-Ligase Nedd4-1 verantwortlich. Somit wurde mit Ack1 ein weiteres zelluläres Wirtsprotein identifiziert, dessen Funktion durch die NS3/4A-vermittelte Spaltung von TC-PTP moduliert wird. Infection with Hepatitis C virus (HCV) is a global problem due to the fact that about 170 million people worldwide are chronically infected with the virus. The undertaken experimental efforts in the last years lead to the assumption that HCV interferes with host cell proteins thereby evolved strategies to circumvent the antiviral immune response. HCV NS3/4A blocks the antiviral immune response of the host through proteolytical cleavage of the adapter proteins CARDIF and TRIF which are essential components of the virus-induced innate immunity. Furthermore NS3/4A interferes with the ligand-induced activation of EGFR signaling through the proteolytic cleavage of the TC-PTP thereby enhancing downstream signal-transduction. As a result a role in the modulation of cell proliferation and regulation of apoptosis is discussed for NS3/4A. In the first part of the thesis stably expressing HCV Core and NS3/4A cell lines were generated by retroviral gene transfer, following biochemical and immunocytochemical characterisation. Parallel to the establishment of cell lines a gene-targeting strategy has been created to generate a conditional, NS3/4A transgenic mouse and the gene-targeting vector has been cloned. The goal of this approach is to provide time- and liver-specific NS3/4A expression using the Cre/loxP recombination system and to enable further in vivo analysis in future. The second part of this thesis confirms that TNFα alone does not induce apoptosis in HepG2 and Huh7 cells but, in combination with the transcriptional inhibitor Actinomycin D, apoptosis can be detected through caspase-3 and PARP-cleavage. However in further experiments a HCV-dependent modulation of the apoptosis was not determined. The analysis of the activiation of the anti-apoptotic transcription factor STAT3 led to the detection of a distinct band specimen due to cross reaction of the phosphotyrosine-specific antibody (Tyr705). Using coimmunoprecipitation the specificity of the cross reaction could be determined. The unknown protein is constitutively phosphorylated in the presence of HCV proteins. A database search identified the nonreceptor tyrosine kinase Ack1 as a putative candidate. In the third part of this thesis it could be demonstrated that cells expressing HCV subgenomic replicon display constitutively phosphorylated Ack1 at tyrosine 857/858, which is located in the EGFR-binding domain in the carboxyl terminus of Ack1. The siRNA-based downregulation of the TC-PTP expression strongly suggest that the cellular tyrosine-phosphatase TC-PTP regulates directly or indirectly the phosphorylation at tyrosine 857/858 of Ack1. The enhanced phosphorylation of Ack1 is independent of the kinase activity of the EGFR and does not alter ligand-induced internalization of EGFR. The use of Ack1 specific siRNA suggests that Ack1 is not essential for the replication of HCV. Due to the fact that Ack1 is a specific downstream target molecule of Cdc42 the upregulation of Cdc42 possibly correlates with the constitutive phosphorylation of Ack1 suggesting a role for Ack1 in virus entry. Western blot analysis reveals a decreased protein level of Ack1 in cells harbouring the subgenomic replicon but not in cells expressing NS3/4A. Interestingly cell lines expressing the subgenomic HCV replicon show an increased protein level of E3 ubiquitin ligase Nedd4-1 which mediates the ubiquitination of Ack1. Hence, Ack1 is a new identified cellular host factor whose function is modulated through the NS3/4A-mediated cleavage of TC-PTP.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.07.2011
Dateien geändert am:	13.07.2011
Promotionsantrag am:	28.01.2011
Datum der Promotion:	06.07.2011