Dokument: Modulation of β-adrenergic receptor structure and function by cardiopathogenic autoantibodies

Titel:	Modulation of β-adrenergic receptor structure and function by cardiopathogenic autoantibodies
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18606
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110708-130832-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bornholz, Beatrice [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,57 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.07.2011 / geändert 08.07.2011
Beitragende:	Univ.-Prof. Dr. Boege, Friedrich [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Stichwörter:	β-adrenergic receptor , DCM, cardiopathogenic autoantibodies
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	At least two human diseases are known to be caused by autoantibodies that bind to hormone receptors and alter their function. One is Grave’s disease a pathologically enhanced growth and endocrine function of the thyroid gland caused by autoantibodies that stimulate the receptor of the thyroidea stimulating hormone. The other is myastenia gravis, an intermittent weakness of skeletal muscles caused by autoantibodies blocking the nicotinic acetyl choline receptor of the neuromuscular endplate. Over the last two decades, several new diseases and target receptors have been added to this list. One is dilated cardiomyopathy, a progressive dilatation and dysfunction of the human heart of largely unknown origin. This disease is now thought to be caused by autoantibodies against β1-adrenergic receptors, which are the transducers of the stimulatory effect of adrenaline and noradrenaline on the heart rate and contractile force. In the blood of patients with dilated cardiomyopathy IgG antibodies that bind to β1-adrenergic receptors and alter receptor function are frequently found. Their removal by immunoadsorption improves heart function. Experimental immunisation of rodents with the respective β1-adrenergic receptor epitopes induces comparable autoantibodies and symptoms and these can be conferred via serum transfer to other healthy animals. Thus, β1-adrenergic receptor autoantibodies could be a target for the therapy of the hitherto incurable disease. However, it is unknown how pathogenic autoantibodies interact with the β1-adrenergic receptor and trigger changes in receptor structure and function leading to the disease. Such knowledge is required to design, indicate and monitor autoantibody-directed therapy. To elucidate the impact of autoantibodies on receptor function, I expressed various biofluorescent constructs of the human β1-adrenergic receptor in a human cell line. This allowed me to titrate IgGs binding to the native receptor on the cell surface, to measure activation-related changes in receptor conformation via intramolecular fluorescence energy transfer (FRET), to monitor dynamics of receptor internalisation and recycling via total internal reflection fluorescence (TIRF), and to determine receptor-mediated changes in cellular cAMP levels. These parameters were used to compare autoantibodies with true receptor ligands and to compare bona fide pathogenic auto-antibodies removed from patients in the course of successful IgG adsorption therapy with autoantibodies purified analogously from the blood of matched healthy volunteers. The investigation shows that: IgG capable of binding to the native human β1-adrenergic receptor on the cell surface were present in all patients with dilated cardiomyopathy and all healthy volunteers. However increased levels of such IgG discriminated patients from volunteers above the 80th percentile. All receptor-specific IgG triggered conformational receptor activation or inactivation; some also inhibited agonist-induced receptor internalisation. cAMP-responses to isoproterenol were potentiated by IgG inducing conformational receptor activation and attenuated by IgG inducing conformational receptor inactivation or inhibiting receptor internalisation. Receptor activation and inhibition of receptor internalisation were more pronounced and frequent by patient IgG. Clinical response to immunoadsorption was best correlated to receptor internalisation inhibition. For the first time this study provides direct evidence that IgG autoantibodies against β1-adrenergic receptors act as allosteric agonists or antagonists. Furthermore, it shows that they can activate or inactivate β1-adrenergic receptors. Also for the first time it is shown that these autoantibodies can inhibit receptor internalisation. These properties are independently related to left ventricular dysfunction and act additive or counteractive to endogenous cAMP regulation. Given this heterogeneity, clinical screening seems best based on receptor-specific IgG levels alone, whereas IgG impact on receptor function could determine therapeutic options. Autoimmunantikörper die an Hormonrezeptoren binden und deren Funktion modifizieren, sind bewiesenermaßen Auslöser für mindestens zwei Krankheiten. Eine davon ist die so genannte Basedowsche Krankheit. Sie ist durch eine pathogene Vergrößerung der Schilddrüse, einhergehend mit einer erhöhten endokrinen Funktion charakterisiert. Ursache dieser Krankheit sind Antikörper, die stimulierend auf den Thyroid Hormon Rezeptor wirken. Die andere bekannte Krankheit ist myastenia gravis, eine periodisch auftretende Muskelschwäche ausgelöst durch Autoantikörper, die den Nikotin Acetyl Rezeptor der motorischen Endplatte blockieren. In den letzten 20 Jahren wurden Hinweise auf viele weitere Autoimmunkrankheiten und beteiligte Rezeptoren gefunden. Eine davon ist die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die sich in einer fortschreitenden Vergrößerung und Dysfunktion des Herzens manifestiert und deren Ursprung unbekannt ist. Bisherige Theorien gehen davon aus, dass diese Krankheit durch Autoantikörper gegen β1-adrenerge Rezeptoren ausgelöst wird, die als Signalüberträger von Adrenalin und Noradrenalin stimulierend auf die Herzrate und Kontraktionskraft des Herzens wirken. Im Blut von Patienten mit DCM konnten Autoimmunantikörper gegen den β1-adrenergen Rezeptor (β1-AR) gefunden werden, die vermutlich die Rezeptorfunktion beeinflussen. Durch Immunadsorption bei der DCM Patienten die Autoantikörper entzogen werden, kann eine Verbesserung der Herzleitung erzielt werden. Immunisierungsexperimente mit Epitopen des β1-AR in Nagetieren zeigen, dass vergleichbare Autoimmunantikörper und vergleichbare Symptome erzeugt werden können, welche via Serumtransfer auch auf gesunde Tiere übertragbar sind. Somit sind Autoantikörper gegen den β1-AR ein viel versprechendes Ziel für neue Therapieansätze dieser bisher unheilbaren Krankheit. Dennoch ist unklar, wie die vermutlich pathogenen Autoantikörper mit dem β1-AR interagieren, dessen Struktur verändern und letztlich DCM verursachen. Basiswissen über diese Zusammenhänge ist jedoch Vorraussetzung für eine frühzeitige Diagnose sowie für Entwicklung und Monitoring einer gegen die Antikörper gerichteten Therapie. Um zu klären welchen Einfluss Autoantikörper auf die Rezeptorfunktion haben, wurden verschiedene biofluoreszente Konstrukte des β1-adrenergen Rezeptors in menschlichen Zellen exprimiert. Das ermöglichte es, die IgG bindenden Autoantikörper zu titrieren und Konformationsveränderungen des Rezeptors mittels intramolekularem Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Außerdem wurden mit diesem Modell die Dynamik der Rezeptorinternalisierung und das Recycling mittels Totaler-Interner-Reflektionsmikroskopie (TIRF) und die rezeptorvermittelte Veränderungen der zellulären cAMP Konzentrationen untersucht. Diese Methoden wurden genutzt um den Effekt von Autoantikörpern aus DCM Patienten mit natürlichen Rezeptor Liganden, als auch gereinigten Antikörpern von gesunden Probanden zu vergleichen. IgG-Antikörper, die in der Lage sind an den β-AR zu binden, finden sich sowohl in der Gruppe der DCM Patienten als auch in allen analysierten Proben der Kontrollgruppe gesunder Probanden. Eine Differenzierung zwischen beiden Gruppen mit 80% Effizienz ist allein aufgrund verschieden hoher rezeptorspezifischer IgG-Konzentrationen möglich. Alle rezeptorbindenden IgGs bewirken eine konformationsabhängige Aktivierung oder Inaktivierung des β1-AR. Für einige IgGs konnte eine Hemmung der Agonisten vermittelten Rezeptorinternalisierung beobachtet werden. Die cAMP-Antwort auf Isoproterenol wurde durch IgGs, die aktive Rezeptorkonformationen induzieren potenziert und Antikörper die die inaktive Rezeptorkonformationen induzieren oder die Internalisierung hemmen reduzierten die cAMP Antwort nach Gabe von Isoproterenol. Rezeptoraktivierung und die Hemmung der Rezeptorinternalisierung kamen bei IgGs aus Patienten ausgeprägter und häufiger vor. Die beste Korrelation zwischen den klinischen Daten der Patienten nach Immunadsorption und den getesteten Parametern ergab sich für die Daten der Internalisierungshemmung. Diese Arbeit erbringt den ersten Hinweis, dass gegen den β1-AR gerichtete IgG Autoantikörper, als allosterische Agonisten oder Antangonisten agieren. Es konnte gezeigt werden, dass sie den Rezeptor entweder aktivieren oder auch inhibieren, und, dass diese Autoantikörper die Rezeptorinternalisierung hemmen. Dieses Eigenschaften stehen unabhängig von einander in Bezug zur linksventrikulären Herz Dysfunktion und wirken verstärkend oder hemmend auf die endogene cAMP Regulation. Die unterschiedlichen beobachteten Effekte zeigen, dass eine valide klinische Diskriminierung zwischen Patient und Proband nur basierend auf den Unterschieden in der IgG-Konzentration am effektivsten möglich ist. Darüber hinaus könnten spezifische Effekte der IgGs auf die β1-AR Funktion dazu beitragen therapeutische Ansätze zu individualisieren.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	08.07.2011
Dateien geändert am:	08.07.2011
Promotionsantrag am:	08.12.2010
Datum der Promotion:	12.04.2011