Dokument: NMR solution structures of the MloK1 cyclic nucleotide-gated ion channel binding domain

Titel:	NMR solution structures of the MloK1 cyclic nucleotide-gated ion channel binding domain
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18491
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110627-112943-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schünke, Sven [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.06.2011 / geändert 22.06.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Ion channel, NMR, cAMP
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ion channels activated by cyclic nucleotides play crucial roles in neuronal excitability and sensory signaling. These channels are activated by binding of cyclic nucleotides to their intracellular cyclic nucleotide-binding domain (CNBD). Ligand binding to the CNBD promotes the opening of the channel, most probably by propagating a conformational change from the CNBD to the pore. However, the mechanism underlying the channel activation is only poorly understood. To elucidate the mechanism of channel gating knowledge of the structure of ligand-free and ligand-bound CNBDs is required. One member of ion channels activated by cyclic nucleotides represents the prokaryotic K+-selective MloK1 channel, that has been identified in Mesorhizobium loti. The MloK1 channel forms homotetramers. Each subunit encompasses six transmembrane segments, a signature sequence for potassium selectivity, and a C-terminal intracellular located CNBD. In this study, the three-dimensional structure of the 15 kDa MloK1 CNBD in complex with cAMP was determined by NMR spectroscopy in solution. The root-mean-squared (r.m.s.) displacement of the NMR structure ensemble compared to the average structure is 0.025 nm and 0.068 nm for backbone and for all heavy atoms, respectively. The NMR structure of the CNBD in complex with cAMP features an antiparallel β roll with a short internal α helix, known as phosphate binding cassette (PBC), similar to other CNBDs, the cAMP-dependent protein kinase A (PKA), the catabolite activator protein (CAP), and the exchange protein directly activated by cAMP (Epac). The β roll is topped by a region of four α helices. The binding site is formed by parts of the β roll and the PBC helix that provide interactions to the phosphate and ribose moieties of cAMP. The C-terminal helix is placed like a ‘lid’ above the binding pocket and stabilizes the complex. Side chain R348 of this helix reaches across and interacts with the purine base. Structure determination of the wildtype cAMP-free CNBD was principally impossible, because cAMP co-purifies with the protein and even extensive dialysis fails to remove the ligand to obtain pure cAMP-free protein samples. Therefore, in the present work a procedure was developed that allows preparation of cAMP-free protein for structure determination. It is based on an extensive washing step of matrix-bound CNBD-GST fusion protein. The present work reports for the first time the three-dimensional structure of the wildtype cAMP-free MloK1 CNBD. The NMR structure could be obtained with an ensemble r.m.s. displacement of 0.037 nm and 0.070 nm for backbone and all heavy atoms, respectively. Superposition of cAMP-bound and -free CNBD solution structures show that the β roll is virtually identical. In contrast, the helical portion shows substantial rearrangements between the two CNBDs. The orientation of each helix with respect to the β roll differs remarkably in the two structures. The movement of the C-terminal helix is coupled to a substantial displacement of the N-terminal helix, which is directly connected to the last transmembrane segment of the MloK1 channel. In previous studies, crystal structures of ligand-free MloK1 CNBDs were obtained from R348A and R307W mutants. Both arginine residues are essential for and directly involved in cAMP binding. Mutation of either one of these residues severely impairs cAMP binding affinity and thereby allowed the preparation of cAMP-free CNBD. The crystal structures of the mutants and a crystal structure of CNBD in complex with cAMP are similar to the solution structures. However, a dimeric arrangement was observed only in the crystal structures, and the dimer interface formed by the N-terminus has been proposed to be involved in channel gating (Clayton et al. 2004; Altieri et al. 2008). In contrast to these observations the MloK1 CNBD exists as a monomer in solution, even at high concentrations required for NMR measurements (0.5 mM in this case). This is supported by 15N relaxation experiments that reveal an isotropic rotational correlation time of 8.4 ns and 8.5 ns for the cAMP-free and cAMP-bound CNBD, respectively. These data are consistent with a monomeric CNBD in solution and are clearly below the value expected for a dimer. There is a striking difference between the crystal and solution structures: The N-terminal helix is straight in the solution structures rather than bent. Additionally, in a structure revealed by electron microscopy of the full-length MloK1 channel the CNBDs appear as independent domains separated by discrete gaps, suggesting that CNBDs are not interacting with each other (Chiu et al. 2007). NMR structures of the wildtype cAMP-free and -bound MloK1 CNBD provide for the first time insights on conformational events that accompany gating within the ligand-binding site. A comparison of both structures allows to speculate that pulling a single ’leash’ on one subunit could be sufficient enough to activate the channel. Zyklische Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle in der neuronalen Erregbarkeit und in der Signaltransduktion primärer Sinneszellen. Die Kanäle werden durch die Bindung zyklischer Nukleotide an eine intrazelluläre zyklische Nukleotid-Bindedomäne (CNBD) aktiviert. Die direkte Bindung zyklischer Nukleotide an die CNBD begünstigt die Öffnung des Kanals, vermutlich werden fortlaufende Konformationsänderungen beginnend von der CNBD bis zur Kanalpore übertragen. Der grundlegende Mechanismus der zur Aktivierung des Kanals führt ist weitgehend unbekannt. Um den Mechanismus der Kanalaktivierung verstehen zu können, sind Informationen über die Raumstruktur der CNBD im zyklischen-Nukleotid gebundenen und im freien Zustand nötig. Der K+-selektive MloK1 Kanal ist ein Mitglied der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle und wurde in dem Bakterium Mesorhizobium loti entdeckt. Der MloK1 Kanal setzt sich aus vier gleichen Untereinheiten zusammen, die zusammen ein Tetramer bilden. Jede Untereinheit enthält sechs Transmembransegmente, eine charakteristische Sequenz für die Selektivität von Kaliumionen und eine C-terminale, intrazellulär vorliegende CNBD. In der vorliegenden Arbeit wurde die Raumstruktur der CNBD des MloK1 Kanals im Komplex mit cAMP mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Lösungsstruktur des cAMP-gebundenen Proteins wurde mit einer Präzision von 0.025 nm und 0.068 nm r.m.s.-Abweichung der Proteinrückgrat- und aller Schweratom-Positioen in einer Konformerenschar bestimmt. Ähnlich zu bereits strukturell charakterisierten Bindedomänen für zyklische Nukleotide wie der Proteinkinase A (PKA), dem Katabolit-Aktivatorprotein (CAP) und dem Guaninnukleotid-Austauschfaktor Protein (Epac) besteht die Raumstruktur aus einer β Faltblattrolle und einer kurzen internen α Helix. Letztere ist auch bekannt als Phosphatbindekassette (PBC). Über der β Faltblattrolle positioniert befinden sich vier zusätzliche α Helices. Ein Teilbereich der β Faltblattrolle sowie die Phosphatbindekassette bilden die Bindestelle für zyklische Nukleotide. Dieser Bereich zeigt direkte Wechselwirkungen zum Phosphat und dem Ribosering des zyklischen Nukleotids. Die C-terminale Helix ist über der cAMP-Bindestelle positioniert und stabilisiert diesen Komplex indem die Seitenkette von R348 über der Purinbase liegt und mit dieser interagiert. Bisher war es nicht gelungen die Struktur der wildtyp cAMP-freien CNBD zu lösen. Nach der Proteinexpression liegt die CNBD weitgehend im cAMP-gebundenen Zustand vor und cAMP kann selbst durch intensive Dialyse nicht vom Protein entfernt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein Protokoll entwickelt, um cAMP-freies CNBD Protein in ausreichender Menge für NMR-spektroskopische Untersuchungen herzustellen. Der wesentliche Bestandteil des Protokolls ist ein intensiver Waschschritt des Matrix-gebundenen GST-CNBD Fusions-proteins. So gelang es die NMR Struktur der Nukleotid-freien CNBD mit einer Präzision von 0.037 nm und 0.070 nm r.m.s.-Abweichung der Proteinrückgrat- und aller Schweratompositionen in einer Konformerenschar zu bestimmen. Eine Überlagerung der NMR Strukturen der cAMP-gebundenen und -freien CNBD zeigt dass die Strukturbereiche der β Faltblattrolle in beiden Strukturen nahezu identisch sind. Im Gegensatz dazu zeigen die α helikalen Bereiche erhebliche Unterschiede. Die jeweiligen Positionen der Helices sind sehr unterschiedlich im Vergleich zur β Faltblattrolle. Die Positionsänderung der C-terminalen Helix führt zu einer erheblichen Positionsverschiebung der N-terminalen Helix. Diese Helix ist im Kanal direkt mit dem letzten Transmembransegment verbunden. In bisherigen Studien konnten Kristallstrukturen der cAMP-freien CNBD durch die Einführung von Punktmutationen der Aminosäurereste R348A und R307W gelöst werden. Beide Argininreste sind direkt an der Bindung von cAMP an die CNBD beteiligt. Durch die Einführung der jeweiligen Punktmutation, wurde die Affinität der cAMP-Bindung erheblich vermindert, was die Preparation der cAMP-freien CNBD ermöglichte. Die Kristallstrukturen der cAMP-freien und cAMP-gebundenen CNBD sind den entsprechenden Lösungsstrukturen recht ähnlich. In allen Kristallstrukturen wurde jedoch eine dimere Anordnung der CNBDs zueinander festgestellt. Die dimere Grenzfläche setzt sich aus der Interaktion der ersten beiden N-terminalen α Helices einer CNBD mit den ersten beiden N-terminalen α Helices einer weiteren CNBD zusammen. Diese Beobachtung führte zu dem Vorschlag, dass die dimere Anordnung der CNBDs untereinander bei der Aktivierung des Kanals eine wichtige Rolle spielt (Clayton et al. 2004; Altieri et al. 2008). Im Gegensatz dazu ist die MloK1 CNBD in Lösung ein monomeres Protein und eine dimere Anordnung der CNBDs konnte in den NMR Strukturen nicht beobachtet werden, selbst bei der für die Strukturaufklärung benötigten hohen Proteinkonzentration (in diesem Fall 0.5 mM). Die Durchführung von 15N Relaxationsexperimenten bestätigt die Beobachtung des monomeren Proteins in Lösung. Isotrope Rotationskorrelationszeiten von 8.4 ns und 8.5 ns wurden für die cAMP-freie und cAMP-gebundene CNBD gemessen. Diese Werte liegen eindeutig unterhalb des Erwartungswertes für ein dimeres Protein in Lösung. Der größte Unterschied der NMR Strukturen im Vergleich zu den Kristallstrukturen liegt im Bereich der N-terminalen Helix: In den Lösungsstrukturen ist die Helix eher geradlinig als gekrümmt ausgeprägt. Zusätzlich konnten in einer elektronenmikroskopischen Struktur des ganzen MloK1 Kanals einzelne CNBDs getrennt beobachtet werden (Chiu et al. 2007). Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die CNBDs vermutlich nicht miteinander interagieren.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	27.06.2011
Dateien geändert am:	27.06.2011
Promotionsantrag am:	30.04.2010
Datum der Promotion:	25.06.2010