Dokument: Identifizierung und Charakterisierung neuer Adipokine - Atherogener Einfluss von Adipozyten-sekretierten Faktoren auf humane vaskuläre glatte Muskelzellen

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung neuer Adipokine - Atherogener Einfluss von Adipozyten-sekretierten Faktoren auf humane vaskuläre glatte Muskelzellen
Weiterer Titel:	Identification and Characterization of novel Adipokines - Atherogenic impact of adipocyte-secreted factors on human vascular smooth muscle cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18490
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110627-110213-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lamers, Daniela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.06.2011 / geändert 21.06.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Eckel, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Es ist seit einigen Jahren akzeptiert, dass das Fettgewebe neben seiner Funktion als Energiespeicher auch ein endokrines Organ darstellt. Eine Zunahme der Fettgewebsmasse bei Adipositas geht mit der Entstehung von chronischen Krankheiten wie Typ 2 Diabetes und Herz‐Kreislauf‐Erkrankungen einher. Es wird angenommen, dass diese Korrelation u.a. auf der gesteigerten Sekretion einer Vielzahl von biologisch aktiven Proteinen und Peptiden aus dem Fettgewebe beruht, die auch als Adipokine bezeichnet werden. Kürzlich erschienene Sekretomstudien konnten neue Einblicke in das komplexe Sekretom von Adipozyten geben und lassen vermuten, dass viele Adipokine bis heute noch unentdeckt sind. Deshalb lag das erste Ziel dieser Arbeit in der Sekretomanalyse in vitro differenzierter humaner Adipozyten und der anschließenden Validierung und Charakterisierung einiger ausgewählter Proteine. Dieser Ansatz führte zur Identifizierung von insgesamt 347 Proteinen, von denen sich nach bioinformatischer Analyse 263 Proteine als sekretorisch erwiesen. Nach Abgleich mit der Literatur erachten wir 44 Proteine als potentiell neue Adipokine. Die fünf interessantesten Kandidaten, Hämoxygenase 1 (HO‐1), αB‐Crystallin (CRYAB), Komplement Faktor H (CFH), cartilage intermediate layer protein (CILP) und Dipeptidylpeptidase IV (DPP4) wurden validiert und charakterisiert. Mittels Western Blot und/oder ELISAs konnte gezeigt werden, dass alle fünf Proteine von Adipozyten sekretiert werden und eine differenzierungsabhängige Expression in Adipozyten aufweisen. Der Vergleich der Expression in Adipozyten und primären Makrophagen, die aus dem Fettgewebe isoliert wurden, deutet bei allen fünf Adipokinen darauf hin, dass hauptsächlich Adipozyten den Ursprung für diese Proteine im Fettgewebe darstellen. Die vergleichende Serumanalyse von schlanken und adipösen Probanden zeigte, dass die Menge an HO‐1, DPP4 und CFH in adipösen Probanden erhöht ist, wohingegen CILP vermindert ist. Für DDP4 konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Proteinexpression in Fettexplantaten von Adipösen im Vergleich zu Schlanken ansteigt und dass diese Expression in viszeralem Fett höher ist als in subkutanem Fett. Desweiteren konnten wir durch die Sekretomanalyse in vitro differenzierter humaner Adipozyten zeigen, dass der pigment epithelium‐derived factor (PEDF) eines der abundantesten Proteine im Sekretom der humanen Fettzelle ist. Die Freisetzung von PEDF aus Adipozyten ist signifikant höher als aus anderen primären Zellen wie Makrophagen, was darauf hindeutet, dass Adipozyten für die PEDF Sekretion im Fettgewebe verantwortlich sind. In Adipozyten, Skelettmuskelzellen und glatten Muskelzellen induzierte PEDF Insulinresistenz auf Ebene der Akt Phosphorylierung. In glatten Muskelzellen steigerte PEDF die Proliferation, aber nicht die Migration und führte zur akuten Aktivierung von proliferativen und inflammatorischen Signalwegen (NF‐κB, p38 MAPK und mTOR). Ein weiterer Themenbereich dieser Arbeit befasste sich mit der atherogenen Wirkung von Adipokinen und freien Fettsäuren auf glatte Muskelzellen. Es ist bekannt, dass die erhöhte Sekretion von Adipokinen und freien Fettsäuren bei der Adipositas eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Atherosklerose spielt. Obwohl die Wirkung von einzelnen Adipokinen auf frühe Ereignisse der Atherosklerose, wie der Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen, gezeigt werden konnte, ist über die Wirkung von Adipozyten‐konditioniertem Medium bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass konditioniertes Medium von humanen in vitro differenzierten Adipozyten zur Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen führt. Desweiteren erhöhte konditioniertes Medium die Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM‐1 und aktivierte proliferative und inflammatorische Signalwege (p38 MAPK, mTOR und NF‐κB). Die autokrine Wirkung von Adiponectin, bekannt als anti‐atherogenes und kardioprotektives Adipokin, hat die vom konditionierten Medium induzierte Proliferation und ICAM‐1 Expression fast vollständig aufgehoben. Die Kombination von konditioniertem Medium, das selbst keine freien Fettsäuren enthält, und Ölsäure führte zu einer synergistischen Induktion der Proliferation und Aktivierung von NF‐κB im Vergleich zu beiden Faktoren alleine. Die Analyse verschiedener NF‐κB Zielgene mittels RT‐PCR zeigte, dass die mRNA Expression der zytosolischen Superoxid Dismutase 1 nur in der Kombination von konditioniertem Medium und Ölsäure signifikant vermindert ist. Die Kombination von konditioniertem Medium und Palmitinsäure induzierte synergistisch die mRNA Expression von IL‐6 verglichen mit beiden Faktoren alleine. Desweiteren führten sowohl die Kombination von konditioniertem Medium mit Ölsäure, als auch mit Palmitinsäure zu einer verminderten Expression von CIDEA in glatten Muskelzellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Sekretomanalyse ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung des Adipozytensekretoms darstellt. Hiermit konnten wir 44 neue Adipokine identifizieren, von denen die fünf interessantesten validiert und charakterisiert wurden. Desweiteren konnte diese Arbeit zeigen, dass die Inkubation von glatten Muskelzellen mit Adipozyten‐konditioniertem Medium, mit oder ohne freie Fettsäuren, ein gutes Model darstellt, um den Crosstalk zwischen den beiden Zelltypen im Hinblick auf die Entstehung der Atherosklerose näher zu charakterisieren. In recent years it has become well accepted that adipose tissue not only functions as energy storage but can also be viewed as a full endocrine organ. The enlargement of adipose tissue mass in obesity frequently associates with the development of chronic diseases, including type 2 diabetes and cardiovascular disease. This correlation is suggested to be due to an increased release of numerous proteins and bioactive peptides by adipose tissue, known as adipokines, leading to a crosstalk between liver, muscle and fat which underlies the progression of these diseases. In this regard, considerable research in recent years has focused on the characterization of adipose tissue secretome, trying to obtain insight into the complex secretory output and relevant proteins probably involved in obesity‐related disorders. Although several proteomic approaches based on adipocytes or adipose tissue explants emphasized the complex nature of the whole secretory output, the adipokinome of human adipocytes remains incompletely characterized. Therefore, one aim of this thesis was to conduct a comprehensive proteomic profiling of conditioned media derived from in vitro differentiated human adipocytes. Here, we could identify a total of 347 proteins, with 263 secreted proteins according to bioinformatics analysis. Literature research led to the identification of 44 proteins, which we consider to be potential novel adipokines secreted from primary human adipocytes. Subsequently, the five most interesting target proteins, namely heme oxygenase 1 (HO‐1), αB‐crystallin (CRYAB), complement factor H (CFH), cartilage intermediate layer protein (CILP), and dipeptidyl peptidase IV (DPP4) were further validated and characterized. By means of immunoblot and/or ELISAs we could validate all five proteins to be secreted by human adipocytes and we could further demonstrate that all candidates are expressed in human adipocytes in a differentiation dependent manner. Comparing the expression in adipocytes with expression in adipose tissue‐derived macrophages indicated that the source of these five novel adipokines in adipose tissue is likely to be represented by adipocytes. Additionally, serum analysis from lean and obese subjects revealed that HO‐1, DPP4, and CFH levels are increased in the obese state, whereas the level of CILP is decreasing. For DPP4 we could also show that its protein abundance in fat explants is elevated in obese compared to lean subjects and that this expression level is also increased in visceral vs. subcutaneous adipose tissue. Secretome analysis of human adipocytes also revealed the pigment epithelium-derived factor (PEDF) as a high abundant adipokine. Adipose tissue‐derived macrophages only secrete low amounts of PEDF, pointing to adipocytes as its main source in adipose tissue. In addition, PEDF was shown to induce insulin resistance and inflammatory signaling in adipocytes, skeletal and smooth muscle cells. Furthermore, PEDF enhances proliferation, but not migration of smooth muscle cells and activates proliferative and inflammatory signaling mediators (mTOR, p38 MAPK, and NF‐κB). A further topic of this work was to address the atherogenic impact of adipokines and free fatty acids on the level at smooth muscle cells. In this context, several studies in humans and animals could show that obesity strongly correlates with the development of atherosclerosis. Although it could be demonstrated that specific adipocyte‐derived factors are involved in regulating vascular functions, like smooth muscle cell proliferation and migration, the impact of the whole human adipocyte output on the crosstalk with human smooth muscle cells is only incompletely understood. In the present work, adipocyte‐conditioned medium (which does not contain free fatty acids) induced proliferation and migration of human smooth muscle cells. Further, conditioned medium enhanced the expression of ICAM‐1 and activated proliferative and inflammatory signaling mediators (p38 MAPK, mTOR, and NF‐κB). Autocrine action of adiponectin, which is known as an anti‐atherogenic and cardioprotective adipokine, completely abrogated the conditioned medium‐induced proliferation and ICAM‐1 expression. Combination of conditioned medium with oleic acid synergistically induced proliferation and NF‐κB activation in comparison to both factors alone. Investigation of distinct NF‐κB target genes revealed that the cytosolic superoxide dismutase 1 is significantly decreased only in the combination of conditioned medium and oleic acid. Furthermore, combination of conditioned medium with palmitic acid synergistically increased IL‐6 mRNA expression in comparison to both factors alone. In addition, the combinations of conditioned medium with oleic acid as well as palmitic acid significantly decrease mRNA expression of the lipid droplet coating protein CIDEA in human smooth muscle cells. These findings indicate that the combination of protein factors and lipid mediators augments the deleterious effects in comparison to both conditioned medium and fatty acids alone. In conclusion, proteomic profiling of conditioned medium of in vitro differentiated human adipocytes led to the identification of novel adipokines, which were subsequently validated and characterized. Furthermore, the atherogenic impact of adipocyte‐conditioned medium, either alone or in combination with fatty acids, on the level of smooth muscle cells was investigated. In this context the presented work illustrates several novel aspects of the complex crosstalk of adipocytes and smooth muscle cells in the vascular wall.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Deutsches Diabetes-Zentrum
Dokument erstellt am:	27.06.2011
Dateien geändert am:	27.06.2011
Promotionsantrag am:	18.03.2011
Datum der Promotion:	06.06.2011