Dokument: Crystallisation and functional studies with ethylene receptor ETR1

Titel:	Crystallisation and functional studies with ethylene receptor ETR1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18413
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110608-111718-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Buchen, Elisa [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.06.2011 / geändert 08.06.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Groth, Georg [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The gas ethylene has a wide influence on various physiological and developmental processes within plants including senescence and abscission of petals, leafs and fruits. The plant hormone is also known as a mediator of biotic and abiotic stress responses upon flooding, drought or pathogen infection. Genetic studies in the model plant Arabidopsis thaliana revealed that binding of ethylene occurs at specific receptor proteins located at the endoplasmic reticulum. To ultimately understand how these membrane proteins perceive and transmit the ethylene signal throughout a complex network and to elucidate potential interactions with other proteins of the signalling cascade, it is essential to analyse and characterise the receptors at the protein level. Within the first part of this thesis, monitoring of intrinsic tryptophan fluorescence was used in addition to a radioactive assay to characterise ligand binding and phosphorylation events in the ethylene receptor protein ETR1 from Arabidopsis thaliana. Fluorescence based studies indicated interaction of the receptor protein with the copper cofactor necessary for binding of ethylene. Phosphorylation experiments revealed that phosphorylation can occur on further residues in the kinase and receiver domain of the receptor other than the putative sites H353 and D659. In this context, preliminary tests were carried out to use 31P NMR in future experiments to assign these residues. The second part of this thesis aimed to a structural characterisation of the receptor protein by X-ray crystallography. For the first time, it was possible to obtain crystals of the full-length ethylene receptor AtETR1. The crystals diffracted to a resolution of about 11 to 12 Å, but data could not be used for structure determination due to the high mosaicity and anisotropic spot distribution. Comprehensive optimisation including protein modification and variations of the experimental setup was tried but did not improve diffraction quality. For that reason the crystallisation study was expanded to orthologous ETR1s from the moss Physcomitrella patens subsp. patens and the tomato Lycopersicon esculentum. Expression and purification protocols were established for both proteins, and first crystallisation screens already gave spherulitic crystals. Although these crystalline structures are not suitable for diffraction analysis, they outline starting conditions for future crystallisation approaches. Ethylen greift als Pflanzenhormon in eine Vielzahl von physiologischen und entwicklungs-relevanten Prozessen der Pflanze ein. Hierzu gehören unter anderem die Seneszenz und Abszission von Blüten und Blättern, sowie die Förderung der Fruchtreife. Ethylen kann außerdem spezifische Stressantworten auslösen, die durch biotische und abiotische Umweltreize wie z.B. Pathogenbefall oder Trockenheit initiiert werden. Die Wahrnehmung eines Ethylensignals erfolgt über Rezeptorproteine am endoplasmatischen Retikulum. Der genaue Mechanismus, mit dem die Signalerkennung und weiterleitung auf molekularer Ebene über ein komplexes Proteinnetzwerk verläuft, ist noch nicht hinreichend bekannt. Sowohl die funktionelle Charakterisierung der beteiligten Proteine als auch strukturbiologische Ansätze können dazu beitragen, den Signaltransduktionsmechanismus weiter zu entschlüsseln. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Studien am Rezeptorprotein ETR1 aus Arabidopsis thaliana durchgeführt: In einem fluoreszenzbasierten Ansatz ließ sich über Änderungen in der Fluoreszenzintensität intrinsischer Tryptophanreste eine Interaktion zwischen dem Rezeptorprotein und dem für die Bindung von Ethylen notwendigen Kupfer-Kofaktor nachweisen. Phosphorylierungsstudien mit radioaktiv markiertem ATP zeigten außerdem, dass neben den bereits beschrieben Aminosäuren (H353 und D659) in der Kinase- bzw. Empfängerdomäne von ETR1 weitere Reste phosphoryliert werden können. In diesem Zusammenhang wurden Vorversuche durchgeführt, um zukünftig 31P NMR zur Identifizierung der entsprechenden Reste anzuwenden. Der zweite Teil der Arbeit umfasste die Kristallisation des Ethylenrezeptors AtETR1. Erstmals konnten Kristalle des kompletten Membranproteins gezüchtet werden. Diese streuten bis zu einer Auflösung von 11 bis 12 Å. Allerdings konnten die Daten aufgrund der vorhandenen Mosaizität und anisotropen Verteilung der Reflexe nicht zur Strukturlösung herangezogen werden. Da eine Verbesserung dieser Eigenschaften auch durch vielfältige Variationen der Kristallisationsparameter und durch Modifikationen des Proteins nicht erzielt werden konnte, wurden zwei weitere orthologe Rezeptoren in die Studie aufgenommen: ETR1 aus dem Moos Physcomitrella patens subsp. patens und der Tomate Lycopersicon esculentum. Nach Etablierung von Expressions- und Reinigungsprotokollen zeigten beide Proteine in ersten Kristallisationsscreens bereits die Bildung von Sphärolithen, so dass diese Bedingungen als Ausgangspunkt für zukünftige Studien dienen können.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	08.06.2011
Dateien geändert am:	08.06.2011
Promotionsantrag am:	18.02.2011
Datum der Promotion:	14.04.2011