Dokument: Autodisplay komplexer Enzyme für biokatalytische Anwendungen

Titel:	Autodisplay komplexer Enzyme für biokatalytische Anwendungen
Weiterer Titel:	Autodisplay of complex enzymes for biocatalytical applications
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18227
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110523-075645-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kranen, Eva [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,96 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.05.2011 / geändert 16.05.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Jose, Joachim [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Proksch Peter [Gutachter]
Stichwörter:	Autodisplay, Enzyme, Biokatalyse, Escherichia coli, Oberflächenexpression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden eine homodimere Prenyltransferase aus Aspergillus fumigatus und eine homotetramere NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis mittels Autodisplay an die Oberfläche von Escherichia coli gebracht. Diese beiden Enzyme können als komplexe Enzyme bezeichnet werden, da sie aus zwei bzw. vier Untereinheiten bestehen und im Fall der NADH-Oxidase (NOx) einen FAD-Cofaktor pro Untereinheit enthalten. Dieser muss in das Enzym inkorporiert werden, damit dieses oxidative Aktivität zeigen kann. Die Oberflächenständigkeit beider Enzyme konnte durch einen Zugänglichkeitstest für extern zugegebene Proteasen belegt werden. Nach Anzucht in LB-Medium zeigte der NOx-Ganzzellbiokatalysator eine Aktivität von 5,54 mU/mL bei Einsatz einer optischen Dichte bei 578 nm (OD578) von 1. Wurde der NOx-Ganzzellbiokatalysator in M9-Minimalmedium kultiviert, konnte die Aktivität auf 16,38 mU/mL bei einer OD578 von 1 gesteigert werden. Der NOx-Ganzzellbio-katalysator war in Zellsuspensionen mit einer OD578 von 10 bei 20 °C und 70 °C ohne Verlust an Aktivität und ohne Verlust der Zellintegrität sieben Wochen lagerfähig. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in fünf wiederholten Reaktionszyklen ließ sich am Ende des fünften Zyklus unter den gewählten Bedingungen noch eine NADH-Oxidase-Aktivität von 50 % verglichen mit dem ersten Zyklus detektieren. In einem kombinierten Einsatz mit einer Acetaldehyd-Dehydrogenase konnte der NOx-Ganzzellbiokatalysator erfolgreich zur Regeneration des oxidierten Pyridinnukleotid-Cofaktors NAD+ eingesetzt werden. Die Prenyltransferase FgaPT2 zeigt ein sehr breites Substratspektrum und akzeptiert neben dem originären Substrat Tryptophan auch 17 weitere Indolderivate. Die Aktivität des FgaPT2-Ganzzellbiokatalysators wurde durch die erfolgreiche Prenylierung der Substrate Indol-3-propionsäure und L--Homotryptophan belegt, von denen jeweils 1 mM eingesetzt worden war. Dabei wurden nach 24 stündiger Reaktionsdauer etwa 25 % der eingesetzten Indol-3-propionsäure und 13 % des eingesetzten L--Homotryptophans durch den FgaPT2-Ganzzellbiokatalysator umgesetzt. LC-MS-Untersuchungen bestätigten die Identität der entstandenen 4 Dimethylallyl-Produkte. Der FgaPT2-Ganzzellbiokatalysator zeigte nach vierwöchiger Lagerung bei 8 °C keinen Aktivitätsverlust. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in drei wiederholten Reaktionszyklen ließ sich auch mit diesem Ganzzellbiokatalysator unter den gewählten Bedingungen eine Umsetzungsrate von 50 % während des letzten Reaktionszyklus verglichen mit dem Anfangswert detektieren. In this study, a homotetrameric NADH-oxidase (NOx) from Lactobacillus brevis and a homodimeric prenyltansferase from Aspergillus fumigatus were displayed on the surface of Escherichia coli using Autodisplay. The active enzymes can be regarded as complex enzymes, since they are known to be composed of two and four subunits, respectively, a factor that often adversely affects heterologous protein expression. In case of NOx, the enzyme also contains one FAD-cofactor per subunit. Surface exposure of both enzymes was proven by accessibility testing for externally added proteases. After cultivation in LB-medium, the NOx-whole cell biocatalyst showed an activity of 5.54 mU/mL, based on measurements with cells at an optical density at 578 nm (OD578) of 1. By cultivation in M9-minimal medium, the activity could be raised to 16.38 mU/mL at an OD578 of 1. Suspensions of the NOx-whole cell biocatalyst with an OD578 of 10 could be stored for seven weeks at 20 °C or 70 °C without any loss of activity or demonstrated membrane integrity. The NOx-whole cell biocatalyst was reusable through five consecutive cycles. In comparison to the first cycle, the surface displayed enzyme retained 50 % of its activity after the fifth cycle. In a combined assay with an acetaldehyde dehydrogenase, the NOx-whole cell biocatalyst was successfully used for NAD+-cofactor regeneration. The native substrate of the aromatic prenyltransferase FgaPT2 is tryptophan, however the enzyme shows a broad substrate spectrum and accepts 17 indole derivatives as substrates. The FgaPT2-whole cell biocatalyst constructed in this study was proven to efficiently prenylate both indole-3-propionic-acid and L--homotryptophan (at substrate concentrations of 1 mM). After a reaction time of 24 h, the FgaPT2-whole cell biocatalyst converted 25 % of indole-3-propionic-acid and 13 % of L--homotryptophan. The identity of the resulting 4-dimethylallyl products was determined by LC-MS. After four weeks of storage at 8 °C the FgaPT2-whole cell biocatalyst showed no loss in activity. The reusability of the FgaPT2-whole cell biocatalyst was tested throughout three consecutive reaction cycles. After the third cycle a conversion rate of 50 % compared to the first cycle was determined, demonstrating the excellent enzyme stability of the autodisplayed protein.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	23.05.2011
Dateien geändert am:	23.05.2011
Promotionsantrag am:	10.12.2010
Datum der Promotion:	13.01.2011