Dokument: Erkennungsmechanismen in der Flechtensymbiose - Präkontakt-Studien und molekulare Analyse
| Titel: | Erkennungsmechanismen in der Flechtensymbiose - Präkontakt-Studien und molekulare Analyse | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18085 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110803-144258-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Meeßen, Joachim [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Ott, Sieglinde [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | lichenology; lichen symbiosis; Fulgensia bracteata; mycobiont; photobiont; biont recognition; recognition mechanisms; pre-contact interaction; mycobiont growth patterns; growth arrest; biont exudation; exudate-dependent germination rate; recognition-dependent gene expression; | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung
Die Ergebnisse von in vitro Präkontakt-Interaktionsassays mit dem Mycobionten von Fulgensia bracteata und verschiedenen Algen bestätigen mehrere Annahmen: a) Die initiale Bionteninteraktion beginnt mit einer für Flechten postulierten und für andere Symbiosen bereits nachgewiesenen Präkontaktphase. b) Sie ist durch signifikante morphologische Veränderungen des Mycobionten charakterisiert, die von der Art der im Präkontakt angebotenen Algen abhängen. c) Diese Veränderungen des Mycobionten von F. bracteata lassen sich im Kontext mit anderen Forschungsergebnissen als das Ergebnis unterschiedlich stark ausgeprägter Erkennungsreaktionen interpretieren und zeigen, dass die Mechanismen von Spezifität und Selektivität für die Lichenisierung bereits im Präkontakt wirken. Unter Kontrollbedingungen zeigt sich ein geringes, stagnierendes und undifferenziertes Wachstum der Mycelien. Dies wird als growth arrest-Strategie interpretiert, die die Persistenz des Pilzes am Keimungsort sichert und so die Wahrscheinlichkeit auf den spezifischen Biontenkontakt erhöht. In allen Proben unter Einfluss von Algen ist dieser growth arrest aufgehoben. Unterschiedliche Keimungs- und Wachstumsraten scheinen weitere Strategien zu sein, die die Überlebenschancen unlichenisierter Mycelien erhöhen. Die drei experimentell angebotenen Algen beeinflussen sehr stark die Entwicklung des Mycobionten nach der Keimung. Alle Einflüsse sind unabhängig von der Nährstoffverfügbarkeit des Mediums. Unter dem Einfluss des unspezifischen Photobionten Asterochloris sp. (aus Lecidea lurida) zeigt sich das signifikant schwächste Hyphenwachstum. Die Mycelien zeigen ein loses, netzartig verbundenes Wachstumsmuster mit wenig Gallertbildung. Unter dem Einfluss des spezifischen arteigenen Photobionten (Trebouxia sp.) zeigt sich ein weit darüber hinausgehendes Hyphenwachstum mit einer verstärkten Gallertbildung und einem radialen, kompakt-flachen Wachstumsmuster. Der Präkontakt mit der nicht-lichenisierenden Alge Myrmecia bisecta fördert das Hyphenwachstum am stärksten. Die Gallertbildung bleibt hinter der mit dem arteigenen Photobionten zurück. Die große Anzahl auswachsender Lufthyphen, die unter allen anderen Bedingungen nur vereinzelt gebildet werden, führt zu einem radialen, aber sphärisch-kompakten Wachstumsmuster. Hyphenlänge, Gallertisierung und Wuchsform, aber auch Lufthyphenbildung und hyphal tip swellings werden von der Identität der experimentell angebotenen Alge beeinflusst. Während der Gallertbildung eine erkennungsspezifische Bedeutung zuzukommen scheint, ist das Hyphenlängenwachstum der am stärksten beeinflusste Faktor. Die Verzweigungshäufigkeit hängt direkt von der Hyphenlänge ab; sie wird im Präkontakt durch keine der angebotenen Algen beeinflusst. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der Mycobiont von F. bracteata auf den arteigenen Photobionten mit spezifischen, koordinierten Präkontaktreaktionen antwortet, auf den unspezifischen Photobionten hingegen mit anderen, angepassten, aber anders ausdifferenzierten Präkontaktreaktionen. Dies deutet auf eine „situationsabhängige adaptive Selektivität“ hin, die es dem Mycobionten erlaubt, mit unspezifischen Photobionten mittelfristige Assoziationen einzugehen und sich an die am Keimungsort vorhandene Algenpopulation anzupassen. Dies sichert sein Überleben und erhöht die Wahrscheinlichkeit auf den spezifischen Biontenkontakt. Die Reaktion des Mycobionten auf die nicht-lichenisierende Alge lässt sich als eine starke, aber unkoordinierte Reaktion auf eine unspezifische und inkompatible Alge deuten. Die unterschiedlichen Präkontakt-Reaktionen des Mycobionten auf die drei Algen deuten darauf hin, dass zur erfolgreichen Erkennung wechselseitige, sorgsam koordinierte Signale zwischen den Bionten ausgetauscht werden müssen. Dies umfasst Signale zur Aufhebung des growth arrest, zur Freisetzung von Nährstoffen durch die Alge, die transferierten Nährstoffe selbst, sowie Signale, die die entsprechende Erkennungsreaktion bewirken und die darauf folgende Reaktion kontrollieren. Neben den eindeutigen Beweisen für differenzielle Reaktionen des Mycobionten von F. bracteata im Präkontakt, geben die Ergebnisse zusätzlich klare Hinweise auf einen komplexen, mehrstufigen und von der Art der Interaktionspartner abhängigen Erkennungsmechanismus. Solche Mechanismen sind bereits detailliert aus anderen Symbiosen bekannt, nicht aber für die Flechtensymbiose. Die Analyse der Algen-Exudate bringt weitere Ergebnisse, die helfen können, die initiale Biontenerkennung aufzuklären: a) Unter Versuchsbedingungen werden von dem Photobionten von F. bracteata, weiteren Photobionten und der Alge M. bisecta eine Vielzahl von chemischen Substanzen in das Kulturmedium ausgeschieden. b) Einige dieser Substanzen werden differenziell in Abhängigkeit von der Art der Alge und des Kulturmediums exudiert, womit sie als potenzielle Signalsubstanzen fungieren können. c) Mit den verwendeten chromatographischen Methoden können vier Exudate identifiziert werden: Indol-3-carbaldehyd, die zyklischen Dipeptide Cyclo-(trp-trp) und Cyclo-(leu-tyr), sowie der Zucker Rhamnose. Andere Substanzen können zwar mit HPLC identifiziert, nicht aber über LCMS etc. verifiziert werden. Dies sind zwei weitere zyklische Dipeptide, Cyclo-(ala-trp) und Cyclo-(pro-tyr), sowie die Desoxynucleoside 2'-Desoxyadenosin und 2'-Desoxythymidin. Jede dieser Substanzen wird zum ersten Mal als Exudat der untersuchten Algen beschrieben. Ob diese Substanzen einen erkennungsrelevanten Einfluss auf den Mycobionten von F. bracteata ausüben, kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse nicht eindeutig beantwortet werden. Einige der identifizierten und in weiteren Versuchen dem Medium zugesetzten Substanzen beeinflussen Keimung und Keimhyphenbildung. Eine weitere, morphologische Reaktion wird jedoch nicht beobachtet, da keine Substanz in den gewählten Konzentrationen den growth arrest aufhebt. Keine der vier Substanzen kann allein für die im Präkontakt-Interaktionsassay beobachteten Reaktionen verantwortlich sein. Einige Befunde eröffnen jedoch die Möglichkeit, dass Cyclo-(trp-trp) Teil des oben beschriebenen Signalaustausches sein könnte, während der hemmende Effekt von Indol-3-carbaldehyd und Rhamnose auf eine regulierende Funktion im Biontenkontakt hindeuten könnte. Eine abschließende Bewertung der Bedeutung dieser Substanzen für die Biontenerkennung ist nicht möglich. Es zeigt sich jedoch, dass die Erkennungsmechanismen durch eine hohe Komplexität gekennzeichnet sind. Zyklische Peptide wurden bereits als sekundäre Inhaltsstoffe in anderen Flechten nachgewiesen. Die Tatsache, dass solche Substanzen auch durch den Photobionten alleine gebildet werden können, zeigt, dass der jeweilige Beitrag der Flechtenbionten zur Synthese bestimmter Inhaltsstoffe detaillierter erforscht werden sollte. Die Ergebnisse der SSH-basierten Expressionsstudien zeigen eindeutig, dass sich mit dem spezifischen Biontenkontakt auch die Genexpression – zumindest – des Mycobionten von Fulgensia bracteata ändert. Es können 35 kontaktspezifisch hochregulierte cDNA-Fragmente und 17 herunterregulierte cDNA-Fragmente identifiziert werden. Von den 35 hochregulierten cDNA-Fragmenten können 25 Fragmente einmal und 10 Fragmente zwei- bis elfmal identifiziert werden. Die Faktoren des Expressionsunterschiedes liegen zwischen 2,0 und 15,6 und die Längen der cDNA-Fragmente sind mit 41 bis 196 bp durchweg kurz. Von 17 herunterregulierten Fragmenten werden neun einmal, fünf zweimal und drei dreimal identifiziert. Die Faktoren des Expressionsunterschiedes liegen zwischen 2,0 und 39,9 und die Längen der cDNA-Fragmente zwischen 41 und 137 bp. Von den 35 kontaktspezifisch hochregulierten cDNAs können sechs Fragmente mittels BLAST-Suche sechs verschiedenen Genen zuordnet werden, die alle aus dem Mycobionten stammen. 29 der kontaktspezifisch hoch- und alle 17 herunterregulierten Gene zeigen keine hinreichenden Übereinstimmungen zu den, in den Datenbanken eingetragenen, Genen. Somit könnten viele der kontaktspezifisch regulierten Gene für Flechtenbionten spezifisch sein. Da kaum genetische Informationen aus Flechtenbionten in den Datenbanken enthalten sind, können solche Gene damit nicht identifiziert werden. Dies eröffnet die prinzipielle Möglichkeit, dass sich in der Flechtensymbiose Erkennungsmechanismen und damit verbunden Gene entwickelt haben, die nicht in nicht-lichenisierenden Organismen vorkommen. Keine Sequenz zeigt eine höhere Ähnlichkeit zu Pflanzen-Genen als zu Pilz-Genen. Dies impliziert, dass die kontaktspezifische Änderung der Genexpression den Mycobionten stärker betrifft als den Photobionten. Manche Autoren vertreten die Hypothese einer asymmetrischen Evolution beider Bionten, wobei der sich sexuell reproduzierende Mycobiont zu einer weitergehenden Anpassung fähig sein soll, als der sich nur asexuell reproduzierende Photobiont (Hill 2009). Sollte sich bestätigen, dass durch den Biontenkontakt hauptsächlich im Mycobionten differenziell exprimierte Gene reguliert werden, so könnte dies als erster Hinweis auf die Richtigkeit der Hypothese gelten. Drei der sechs identifizierten Gene kodieren für ein GTP-bindendes EsdC, das die frühe Sexualentwicklung von Pilzen steuert, für eine dTDP-bindende 4,6-Glucose-Dehydratase und für eine ATP-Sulfurylase. Das EsdC unterdrückt die vegetative zugunsten der generativen Vermehrung. Auch wenn das Einleiten der Sexualentwicklung ein der Erkennung nachgeschalteter Prozess sein sollte, ist die Entdeckung dieses Gens für F. bracteata aufschlussreich, da diese Flechte sehr früh in ihrer Entwicklung Apothecien bildet, aber keine vegetativen Vermehrungseinheiten. Die Glucose-Dehydratase ist ein Enzym zur Synthese von Rhamnose, welche wiederum in vielen Organismen erkennungsrelevant ist. Die Funktion von Rhamnose in der Erkennungsfunktion von EPS, also Gallerte, und Lektinen erscheint für die Biontenerkennung in Flechten besonders interessant. Besonders, da Rhamnose auch als Exudate des Photobionten detektiert werden konnte. Die ATP-Sulfurylase aktiviert Sulfat zu Adenosin-5’-phosphosulfat. Damit erscheint es wahrscheinlich, dass mit dem erfolgten und erfolgreichen Biontenkontakt der Schwefelstoffwechsel im Mycobionten oder auch zwischen beiden Bionten eine Reorganisation erfährt. Die drei weiteren Gene sind eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase, das 60S Ribosomale Protein L29 und ein Protein aus der Domänenfamilie Aha 1. Diese drei Gene spielen entweder als Bestandteil des Ribosoms selber oder als Chaperon bzw. Cochaperon eine Rolle in der Proteinbiosynthese und bei der korrekten Faltung neu synthetisierter Proteine. Das Ribosomale Protein L29 ist ein nicht-essenzieller Bestandteil des Ribosoms und scheint in Pilzen auch eine Bedeutung für die Regulation von Wachstumsprozessen und in einzelnen Entwicklungsstadien zu besitzen. Die Peptidyl-Prolyl-Isomerase ist ein wichtiges Chaperon, das in Pilzen ebenfalls eine Rolle in der Wachstumssteuerung und auch in der Sexualentwicklung spielen kann. Das Protein aus der Domänenfamilie Aha 1 ist als Cochaperon des heat shock protein 90 bekannt. Bedenkt man die vielfältigen Differenzierungsprozesse, die mit der Lichenisierung einhergehen, dann lässt sich die erhöhte Expression dieser Gene mit der Notwendigkeit für intensive Anpassungs- und Reorganisationsprozesse des Mycobionten bei erfolgtem Biontenkontakt erklären. Diese Anpassung an den symbiotischen Status bedarf wahrscheinlich weitreichender Veränderungen hinsichtlich der Proteinbiosynthese und der damit verbundenen Stoffwechselleistungen, die auch auf die Genexpression der drei Gene zurückwirken. Diese Gene sind zwar erkennungsunspezifisch, spielen aber eine bedeutende Rolle bei den zentralen Prozessen der Proteinbiosynthese und Proteinfaltung. Somit können mit dem Biontenkontakt einsetzende Differenzierungs- und Wachstumsprozesse für ihre erhöhte Expression verantwortlich sein. Die hier vorgestellten Ergebnisse, die durch Untersuchungen der Flechte Fulgensia bracteata und ihrer Bionten erarbeitet wurden, repräsentieren einen guten Ausgangspunkt für weitere Forschungen bezüglich der molekularbiologischen Basis der initialen Erkennungs-mechanismen in Flechten, der übertragenen Signalmoleküle und der morphogenetischen Reaktionen des Mycobionten.Summary The results of in vitro pre-contact interaction assays with the mycobiont of Fulgensia bracteata and different algae confirm several assumptions: a) The initial biont interaction starts with a pre-contact phase, that was yet postulated for lichens and verified for other symbioses. b) It is characterized by substantial changes of the mycobiont´s morphology which depend on the identity of the subjected algae. c) In context with other studies, these variations could be interpreted as differential recognition reactions and show that the lichenization-relevant mechanisms of specificity and selectivity are already initialized during pre-contact. The mycelia show low, stagnant, and undifferentiated growth under control conditions when not exposed to any alga. This is interpreted as a strategy for growth arrest to insure the mycobiont´s persistence at the germination site, and to increase the probability of specific contact with the photobiont. The growth arrest is omitted in all samples influenced by algae. Different germination and growth rates seem to be additional general strategies to increase the chances of survival of unlichenized mycelia. The three algae to which the mycobiont is experimentally subjected strongly influence its development after germination independent of the nutrient composition in the respective culture medium. The significantly weakest hyphal growth is observed under the influence of the unspecific photobiont Asterochloris sp. (of Lecidea lurida). The mycelia show a loose, reticulate and interconnected growth pattern with low mucilage production. The influence of the specific photobiont (Trebouxia sp.) leads to strongly enhanced hyphal growth, increased mucilage production, and a radial, plain, and dense growth pattern. The strongest increase in hyphal growth is shown in pre-contact with the non-lichenizing alga Myrmecia bisecta. Compared to the influence of Trebouxia sp., mucilage production is decreased, while the number of aerial hyphae is much higher leading to a radial and dense but spheric growth pattern. Hence, hyphal length, mucilage production, growth pattern, aerial hyphae formation and number of hyphal tip swellings are influenced by the algal species subjected to the mycobiont. Mucilage production seems to be specific for recognition whereas hyphal length is most strongly affected by the algal identity. The branching rate is not influenced by the algae but directly depending on hyphal length. In conclusion, the response of the mycobiont of F. bracteata to Trebouxia sp. is characterized by a specific co-ordinated pre-contact reaction. Its response to the unspecific Asterochloris sp. resembles an adapted but less intense and differentiated pre-contact reaction. This points to an “situation-triggered adaptive selectivity” which enables the mycobiont to temporarily associate with unspecific photobionts and adjust to local algal populations at the germination site. This ensures its survival and enlarges the probability of specific photobiont contact. The mycobiont´s response to the non-lichenized alga suggests a strong but non co-ordinated reaction to an unspecific and incompatible alga. Differential pre-contact reactions of the mycobiont in response to the three algal species indicate that interspecific, well co-ordinated signals are transmitted between potential bionts for successful recognition. That includes signals for omission of growth arrest, for algal nutrient release, nutrient transfer, as well as recognition-specific and -controlling signals. Besides the clear evidence for differential reactions of the mycobiont in the pre-contact phase, the results also stress the existence of a complex, multi-stepped recognition mechanism which is modified by the respective interaction partner. Although such mechanisms are not known for lichens, they are already reported in detail for various symbiont-plant-symbioses. The analysis of algal exudates provides further results to shed light on initial biont recognition. a) Multiple and various chemical substances are exuded by the photobiont of F. bracteata, other photobionts, and the non-lichenizing alga M. bisecta under culture conditions. b) Some of these substances are differentially exuded depending on algal identity and the type of medium. Hence, it might be possible that such exudates act as signaling substances. c) By different chromatographic methods it is possible to identify four exudates: Indol-3-carbaldehyde, the cyclic dipeptides cyclo-(trp-trp) and cyclo-(leu-tyr), and the sugar rhamnose. Other substances are only identified by HPLC but not verified by LCMS. These substances represent the two additional cyclic dipeptides cyclo-(ala-trp) and cyclo-(pro-tyr) as well as the two deoxynucleosides 2'-deoxyadenosine and 2'-deoxythymidine. Each of these substances is reported as photobiont/algal exudate for the first time. According to the obtained results it cannot be clearly concluded if these substances have an influence on the recognition mechanisms of the F. bracteata mycobiont in the lichenization process. In additional culture experiments with the application of the identified substances some of them influence mycobiont germination and germ tube formation. Due to the fact that none of the substances is able to omit the growth arrest in the applied concentrations, no further morphological response can be observed. Therefore, none of the four substances can cause the morphological reactions on its own, which are observed in the pre-contact interaction assays. However, some findings indicate that cyclo-(trp-trp) plays a role in the signal transmission scheme mentioned above, while the inhibitory effect of indol-3-carbaldehyde and rhamnose points to a regulatory function in symbiotic contact. Considering the relevance of these substances for biont recognition no conclusions can be drawn yet. Never-theless it becomes clear that recognition mechanisms are characterized by a high degree of complexity. It is already published that cyclic peptides are secondary metabolites in other lichen species. The fact that such components can be formed by the photobiont on its own suggests that the contribution of each lichen biont to the synthesis of secondary metabolites needs to be examined to more detail. The results of the expression studies by SSH demonstrate that gene expression changes during specific biont contact – at least in the mycobiont of F. bracteata. Thirty-five contact-specific up-regulated and 17 down-regulated cDNA-fragments can be identified. Out of 35 25 fragments are found one times while 10 fragments are found two to eleven times. The factors of expressional up-regulation at biont contact range from 2.0 to 15.6 while the size of the cDNA-fragments is between 41 and 196 bp. Nine out of 17 fragments are covered once five fragments twice and three thrice. The factors of expressional down-regulation at biont contact range from 2.0 to 39.9 while the size of the cDNA-fragments is between 41 and 137 bp. From the 35 contact-specifically up-regulated cDNA-fragments only six fungal genes can be identified by BLAST search whereas 29 up-regulated and none of the 17 down-regulated cDNA-fragments shows any similarity to known database entries. Consequently, some contact-specifically regulated genes could be unique in lichen bionts. Since there is only few genetic database information available on lichen bionts, such genes have to remain unidentified yet. This implies the possibility, that in the course of evolution lichen recognition mechanisms and their constituting genes have evolved, but are not found in non-lichenizing organisms. None of the obtained sequences exhibits a higher similarity to plant-genes than to fungal genes. This might indicate that the mycobiont is stronger affected by contact-triggered changes in gene expression than the photobiont. Some authors hypothesize asymmetrical evolution of both bionts in which the sexually reproducing mycobiont has greater capabilities to adapt to the symbiotic state than the vegetatively reproducing photobiont (Hill 2009). If it could be verified that the mycobiont´s genes are more submitted to differential expression, these results could be regarded as a first hint on the correctness of this hypothesis. Three out of the six identified genes code for a GTP-binding EsdC which regulates the early sexual development of fungi, for a dTDP-binding 4,6-glucose-dehydratase and for an ATP-sulfurylase. EsdC suppresses vegetative in favor of sexual reproduction. Since the lichen F. bracteata forms apothecia early in its development but no vegetative propagules the identification of this gene is very instructive even if the sexual development initiation is a subsequent process to biont recognition. The enzyme glucose-dehydratase is essential for the synthesis of rhamnose, which in turn plays an important role in recognition mechanisms of many organisms. Rhamnose contributes to extracellular polysaccharide (i. e. mucilage) mediated recognition as well as to lectins. This might also indicate a crucial role of rhamnose in lichen recognition processes. Especially because it is also detected as a photobiont exudate. Since ATP-sulfurylase activates sulfate to adenosine-5’-phosphosulfate can be concluded that sulfur metabolism must be re-organized after successful biont contact in one or both partners. The three remaining genes encode a FKBP-C-type peptidyl-prolyl-isomerase, the 60S ribosomal protein L29 and an Aha1 domain family protein. These three genes are important for protein biosynthesis and protein folding as part of the ribosome as well as a chaperone or a co-chaperone. The ribosomal protein represents a non-essential part of ribosomes but also seems to be involved in the regulation of fungal growth and developmental processes. The peptidyl-prolyl-isomerase is a key chaperone and can be part of fungal growth regulation and sexual development. The Aha1 domain family protein is known as a co-chaperone of heat shock protein 90. Considering the manifold differentiation processes during lichenization, the up-regulation of these three genes can be explained by the need for intensive adaptation and re-orientation of the mycobiont after specific contact. The adaptation to the symbiotic state might require intense changes in protein biosynthesis and metabolic processes affecting the respective gene expression. Although the three identified genes do not seem to be connected to biont recognition they play vital roles in protein biosynthesis and folding. Hence, the differentiation and growth processes initiated by biont contact could cause their elevated expression. The results presented in this study and obtained by investigations of the lichen Fulgensia bracteata and its bionts provide a crucial starting point for further research on the molecular basis of initial lichen recognition mechanisms as well as on transmitted signal molecules and mycobiont morphogenesis. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Botanik | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.08.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.08.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.11.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.01.2011 |
