Dokument: New oxidoreductases for the synthesis of chiral building blocks

Titel:	New oxidoreductases for the synthesis of chiral building blocks
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=18014
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110429-100728-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Richter, Nina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.04.2011 / geändert 18.04.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die biokatalytische Synthese wichtiger chiraler Schlüsselbausteinen hat in den letzten Jahren deutlich an Bedeutung gewonnen. Infolgedessen ist der Bedarf an neuen Enzymen, die die Synthese solcher Bausteine katalysieren hoch. Ziel dieser Doktorarbeit war es deshalb, neue Biokatalysatoren zu identifizieren und deren Potential in der Synthese chiraler Synthons aufzuzeigen. Zu diesem Zweck wurde ein in silico Screening, ausgehend von der Sequenz der Glycerol-Dehydrogenase aus dem Pilz Hypocrea jecorina, durchgeführt. Mit Hilfe dieser Strategie gelang es, drei interessante Oxidoreduktasen zu identifizieren und hinsichtlich ihrer Anwendung in biotechnologisch relevanten Reaktionen zu untersuchen. Glycerol Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans (GlyDH): Die GlyDH katalysiert die enantioselektive Reduktion einer Reihe von Aldehyden, sowie die asymmetrische Oxidation verschiedener Alkohole besonders Zuckeralkohole. Aufgrund der hohen Aktivität und Enantioselektivität in der Reduktion von D-Glyceraldehyd konnte die GlyDH erfolgreich in der kinetischen Racematspatlung von racemischen Glyceraldehyd eingesetzt werden. Darüber hinaus wurden für die Produktion von L-Glyceraldehyd zwei alternative Systeme vergleichend untersucht: Ein zellfreies Verfahren basierend auf isolierten Enzymen (GlyDH und Glucose-Dehydrogenase für die Coenzym-Regenerierung) und ein rekombinantes Ganzzellsystem. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte ebenfalls aufgezeigt werden, dass neben der Reduktion auch die Oxidation verschiedener Zuckeralkohole zu enantiomerenreinen Aldosen katalysiert wird. Darüber hinaus, gelang es die Struktur der GlyDH röntgenkristallographisch mit einer Auflösung von 2.0 Å aufzuklären. Die resultierende Kristallstruktur ermöglicht Einblicke in molekulare Mechanismen, die für den katalytischen Mechanismus, die Enantioselektivität sowie die Substratspezifität der GlyDH verantwortlich sind. Carbonyl Reduktase aus Neurospora crassa (NcCR): Die NcCR katalysiert die Reduktion verschiedener Carbonylverbindungen; besonders - und -Ketoester werden mit hohen Aktivitäten umgesetzt. Da jedoch ein geeigneter Prozess unter “Standardbedingungen” nicht möglich war, gelang es, mit Hilfe einfacher Methoden des Reaktionsengineering einen adäquaten Prozess zur Darstellung von - und  Hydroxyestern zu entwickeln. Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans (EnR): Die EnR katalysiert die chemo-, regio- und stereoselektive Reduktion von C=C Doppelbindungen verschiedener aktivierter Alkene. Mit Hilfe der identifizierten EnR gelang es, verschiedene Verbindungen mit hoher biotechnologischer Relevanz wie z.B. (S)-Citronellal und (R)-Levodion selektiv und enantiomerenrein zu synthetisieren. Insgesamt lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit, drei Enzyme mit biotechnologischer Bedeutung identifizieren, klonieren und heterolog exprimiert werden konnten. Des Weiteren konnten diese Enzyme erfolgreich in der Synthese hochwertiger Schlüsselbausteinen eingesetzt werden und somit deren Potential für eine Anwendung in biotechnologischen Prozessen demonstriert werden. Biocatalytic strategies for the synthesis of versatile chiral building blocks have gained increasing interest over the past few decades. Because of the high demand for new enzymes that are capable of catalysing reactions of biotechnological interest, the aim of this thesis was to identify new catalysts that facilitate biocatalytic access to valuable chiral synthons. Using a genome mining approach based on the sequence of the glycerol dehydrogenase GLD1 from Hypocrea jecorina, three interesting oxidoreductases were identified. These enzymes were characterised with respect to their ability to catalyse reactions of biotechnological interest. Glycerol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans (GlyDH): GlyDH catalyses the enantioselective reduction of aldehydes, as well as the asymmetric oxidation of different alcohols and sugar alcohols. According to the high enantioselectivity of GlyDH in the reduction of D-glyceraldehyde, this enzyme can be applied in the kinetic resolution of rac-glyceraldehyde to produce enantiopure L glyceraldehyde on a preparative scale. For this purpose, two different systems have been constructed and studied comparatively: a cell free-system based on isolated enzymes (GlyDH and glucose dehydrogenase for cofactor regeneration) and a constructed recombinant whole-cell catalyst system. In addition, the application of GlyDH in the regio- and stereoselective oxidation was possible, facilitating the enantioselective production of different sugars from sugar alcohols. Moreover, the structure of GlyDH was elucidated by X-ray-crystallography at 2.0 Å resolution. The crystal structure of GlyDH was used to understand the catalytic mechanism, the enantioselectivity and the substrate preference of GlyDH on a molecular level. Carbonyl reductase from Neurospora crassa (NcCR): NcCR catalyses the reduction of different carbonyl compounds, in particular, - and -ketoesters, to produce the corresponding hydroxyesters. A feasible process using NcCR under standard conditions was not possible, but by applying methods of reaction engineering, a feasible process for the production of - and -hydroxyesters was established. Enoate reductase from G. oxydans (EnR): EnR catalyses the chemo-, regio- and stereoselective reduction of C=C double bonds of various activated alkenes. By applying EnR, different compounds with biotechnological interest, such as (S) citronellal and (R)-levodione, were produced. In summary, three enzymes that catalyse interesting reactions were identified, cloned, heterologously expressed and successfully applied in the biocatalytic synthesis of valuable chiral building blocks.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	29.04.2011
Dateien geändert am:	29.04.2011
Promotionsantrag am:	17.05.2011
Datum der Promotion:	28.06.2011