Dokument: Biophysical characterization of ABC transporters catalyzing import and export function

Titel:	Biophysical characterization of ABC transporters catalyzing import and export function
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17775
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110331-115210-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Tschapek, Britta [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,16 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.03.2011 / geändert 31.03.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	ABC transporter
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die hier vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Substraterkennung und Translokation bei ABC-Transportern. ABC-Transporter verkörpern eine der größten Klassen von Membranproteinen. Ihr klassischer Aufbau aus zwei Nukleotidbindendenden (NBD)- und zwei Transmembrandomänen (TMDs) ermöglicht den Transport unterschiedlichster Substrate unter ATP-Verbrauch in allen Reichen des Lebens. Dabei werden Import und Exportsysteme unterschieden. Importsysteme sind bisher ausschließlich in Prokayoten und Archaeen gefunden worden und benötigen zusätzlich noch ein Substratbindeprotein (SBP), welches das Substrat aus dem Periplasma oder dem extracellulären Raum zum Transporter delegiert. Durch Analyse struktureller Daten dieser Substratbindeproteine wird die Substratspezifität, sowie der Mechanismus der Substratbindung und auch des Entlassen des Substrates in die Translokationspore des Transporters an den Beispielen des ABC-Transporters OpuB aus Bacillus subtilis und ProU aus dem thermophilen Archaeon Archaeoglobus fulgidus erklärt werden. SBPs von ABC-Transportern zeigen alle einen ähnlichen Aufbau: Sie bestehen aus zwei unterschiedlich großen Domänen, in deren Mitte sich die Substratbindestelle befindet. Kristallstrukturen von verschiedenen SBPs haben gezeigt, dass diese eine offene Konformation ohne Substrat und eine geschlossene Konformation, bei der Substrat in der Mitte gebunden ist und die beiden Domänen zueinander rotiert sind, einnehmen können. Welche einzelnen Aminosäuren die Substratspezifität der Bindungstasche ausmachen, konnte mittels Analyse der Kristallstrukturen des SBPs OpuBC, das ausschließlich Cholin bindet, und einem Vergleich mit homologen SBPs mit verändertem Substratspektrum gezeigt werden. Für das ProX Protein, das SBP des ABC-Transporters ProU, konnte ein detaillierter Ablauf der Substraterkennung, Bindung und der Entlassung des Substrats in die Translokationspore des Transporters bestimmt werden. Die biophysikalische Untersuchung gesamter ABC-Transporter erfordert die Anwendung von Detergenzien um diese Membranproteine in wässrigen Lösungen zu stabilisieren. Die Etablierung einer Methode zur Bestimmung der kritischen Mizellen Konzentration sowie der Aggregationszahl unterschiedlicher Detergenzien in verschiedensten Pufferlösungen ist ein weiterer Aspekt dieser Arbeit. Beide Parameter sind stark von pH-Wert, Salzkonzentration, Temperatur und Polymeren in der Lösung abhängig. Daher ist eine zuverlässige und schnelle Analyse dieser Parameter ein entscheidender Vorteil, bevor biophysikalische oder strukturelle Analysen an Membranproteinen durchgeführt werden. Mit diesem „Werkzeugkoffer“ konnte die Reinigung und funktionelle Analyse der einzelnen Komponenten des Typ I Sekretionssystems aus Escherichia coli etabliert werden. Dieses System, das das Substrat Hämolysin A in einem Schritt über zwei Membranen transportiert, besteht aus drei Komponenten: Dem ABC-Transporter Hämolysin B (HlyB), dem Membranfusionsprotein Hämolysin D (HlyD) und dem Außenmembranprotein TolC. Dabei besitzt der ABC-Transporter noch eine zusätzliche N-terminale Domäne, die in Sequenzvergleichen sich als C39 Peptidasedomäne herausstellte. Allerdings sind die katalytisch relevanten Aminosäuren mutiert, so dass sie nicht mehr in der Lage ist ihr Substrat zu spalten. Die homologe Expression und Aufreinigung des ABC-Transporters HlyB, sowie die anschließende funktionale Analyse haben gezeigt, dass die Hydrolyseaktivität der NBDs vom Substrat HlyA stimuliert werden kann. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass diese Stimulation nicht auf eine Bindung an die C39 Domäne hervorgerufen wird, sondern es sich um eine Interaktion des Sekretionssignal mit den NBDs handeln muss. Um die Rolle der C39-Domäne zu verstehen, wurde diese separat exprimiert und aufgereinigt und für strukturelle Analysen erflgreich kristallisiert. This work contributes to an understanding of substrate recognition and translocation performed by ABC-transporters. ABC-transporter form one of the largest protein-familiy of membrane proteins. Classically, they consist of two nucleotide binding (NBDs) and two transmembrane domains (TMDs). This architecture facilitates transport of a large variety of substrates using ATP as energy source in all three kingdoms of life. Among these import and export systems are differentiated. Import systems are so far only found in prokaryotes and archaea and require an additional substrate binding protein (SBP), which binds the substrate in the periplasm or extracellular space and delivers it to the transporter. SBPs of ABC-transporter show all a common architecture: They consist of two domains different in size, in between a deep cleft where the substrate binding-site is located. Crystal structures of various SBPs have shown mainly two conformations: one without substrate (open) and one with substrate bound (close) where the substrate is located in the cleft and the two domains have rotated towards each other. Through structural analysis of SBPs substrate specificity, mechanism of substrate binding and release could be illustrated via the example of the ABC-transporter OpuB from Bacillus subtilis and ProU from thermophilic Archaeoglobus fulgidus. The contribution to substrate binding of single amino acids in the binding pocket could be resolved both qualitatively and quantitatively for both proteins. For ProX the SBP of ProU molecular dynamics simulation as well as structural analysis revealed a single amino acid that is responsible for switching the affinity of the binding pocket from a rather low affinity state to a high affinity binding site. Biophysical investigation of full length ABC-transporter requires application of detergents to keep the membrane protein in solution. Establishment of a method for determination of critical micelle concentration (CMC) and aggregation numbers of diverse detergents in various buffer solutions was also one part of this work. Both parameters depend on pH, salt concentration, temperature and polymer concentration in the solution. Thus a reliable and fast analysis of these characteristics is an important advantage prior to start biophysical and structural analysis on membrane proteins. With such a “toolbox” in hand establishing purification and functional analysis of single components of Type I secretion system of Escherichia coli were the next steps. This system, which translocates its substrate Haemolysin A in a single step across two membranes, is composed of three proteins: The ABC-transporter Haemolysin B (HlyB), a so called membrane fusion protein Haemolysin D (HlyD) and the outer membrane protein TolC. The ABC-transporter has a special feature: an additional domain at its N-terminus, which belongs to the family of C39 peptidase domains. However, in HlyB the catalytic relevant residues are mutated and therefore this C39 domain is no longer able to cleave. Homologous overexpression and purification of the ABC-transporter HlyB and subsequent functional assays showed that ATP hydrolysis of NBDs can be stimulated by the addition of substrate (HlyA). This increase ATPase activity does not occur due to binding of HlyA to C39 domain but binding of the secretion signal of HlyA to the NBDs of HlyB. To further investigate the role of C39 domain in the transport cycle, the protein was overexpressed separately, purified and for structural analysis successfully crystallized.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	31.03.2011
Dateien geändert am:	31.03.2011
Promotionsantrag am:	02.02.2011
Datum der Promotion:	02.03.2011