Dokument: Physiologische und regulatorische Konsequenzen der Überproduktion einer Lipase in Pseudomonas
| Titel: | Physiologische und regulatorische Konsequenzen der Überproduktion einer Lipase in Pseudomonas | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17247 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110228-114426-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Funken, Horst [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung:
Mikrobielle Lipasen, darunter die besonders geeigneten Lipasen der Gattung Pseudomonas, finden vor allem Anwendung in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Die Expression von aktiven Lipasen der Familie I.1 aus P. aeruginosa ist jedoch aufgrund der komplexen Regulation, Faltung und Sekretion ein hoch komplexer Prozess. Daher wurden in der Vergangenheit viele Expressionssysteme getestet, um zu einer höheren Produktivität zu gelangen. Nicht nur wegen ihrer biotechnologischen Bedeutung, sondern auch aufgrund ihrer Funktion als Virulenzfaktoren bei pathogenen Mikroorganismen (Stehr et al., 2003) sind Lipasen im wissenschaftlichen Focus. In dieser Arbeit wurde ein systembiologischer Ansatz gewählt, in dem das Gen das für die Lipase A aus P. aeruginosa kodiert im heterologen Wirt P. putida und im homologen Wirt P. aeruginosa exprimiert wurde. Dabei wurden die unterschiedlichen Kulturen mittels Proteomics und qPCR untersucht. Die notwendigen Methoden wurden während dieser Arbeit neu am Institut etabliert. Bei der Anzucht von P. putida unter Expression von lipAH konnte gezeigt werden, dass die heterologe Produktion der Lipase einen Stress ausübt, der das Wachstum deutlich verlangsamt und die Biomasse reduziert. Außerdem zeigte sich überraschend eine deutliche Grünfärbung welche auf eine gesteigerte Pyoverdin Produktion, die unter Standardlaborbedingungen für P. putida unüblich ist, zurück geführt werden konnte. Erstmalig konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Lipaseexpression für die Pyoverdinsynthese notwendig ist, entweder durch die heterologe Lipase oder durch die im Pyoverdincluster natürlicherweise enthaltene Lipase (PP4218). Dieser vorhergesagten Lipase (PP4218) konnte jedoch mit den Standardsubstraten keine typische Lipaseaktivität zugewiesen werden. Das zelluläre Proteom von P. putida zeigte unter Lipaseüberproduktion deutliche Veränderungen bei mindestens 60 Proteinen. Darunter waren Proteine, die mit der oxidativen-Stress Antwort assoziiert sind, als auch solche Proteine, die direkt an der Pyoverdin-Produktion beteiligt sind, was nach den physiologischen Untersuchungen zu erwarten war. Die Analysen im homologen Wirt P. aeruginosa ergaben ebenfalls, dass die Lipase A die Pyoverdin Produktion beeinflusst; obwohl hier, im Gegensatz zu P. putida, kein Lipasegen direkt im Pyoverdincluster vorhanden ist. Einerseits zeigte sich in der Lipase A-defizienten Mutante von P. aeruginosa, dass keinerlei Pyoverdin produziert wird, ein Phänotyp, der durch lipAH in trans komplementierbar war. Andererseits konnte gezeigt werden, dass in dieser Mutante die Transkription des pvdS-Gens deutlich vermindert ist. PvdS ist ein alternativer, sogenannter „iron starvation“-Sigma-Faktor, der für die Transkription des pvd Genclusters verantwortlich ist. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass das Vorhandensein der Lipase A die Transkription von pvdS beeinflusst. Interessanterweise war in einer pvdS-Mutante, P. aeruginosa ΔpvdS, die Transkription des lipA-Gens deutlich verringert, obwohl vor dem Lipasegen die notwendige IS-Box zur Bindung von PvdS nicht vorhanden ist. Doch nicht nur die Pyoverdinproduktion wird in der Lipase A-defizienten Mutante von P. aeruginosa beeinflusst, sondern auch die Transkription der lasR/I und rhlR/I Gene, deren Genprodukte für die Autoregulation und Synthese der Signalmoleküle (Homoserinlaktone) des „Quorum sensing“ (QS) Systems zuständig sind, ist deutlich reduziert. Außerdem findet sich kein PQS („Pseudomonas-Quinolon-Signal“) in Kulturüberständen. Diese Phänomene waren durch die Expression von lipAH in trans komplementierbar. Ein Sekundärmetabolit, welcher durch das „QS“-System reguliert wird, ist das Rhamnolipid von P. aeruginosa. In der Tat konnten keine RL in P. aeruginosa ΔlipAH detektiert werden, bei Expression von lipAH in trans waren beide Rhamnolipide von P. aeruginosa wieder vorhanden. Diese Befunde sind in einem regulatorisches Modell zusammengefasst, in dem durch die Lipase A Aktivität ein putatives Signalmolekül entsteht, welches nach Signaltransduktion sowohl die Gene des QS-Systems als auch das pvdS Gen und somit auch die PvdS-abhängige Genregulation beeinflusst.Summary: Microbial lipases, especially those from the genus Pseudomonas, are often used in chemical and pharmaceutical industries. The expression of active lipases of P. aeruginosa from family I.1 is often very difficult, because it depends on complex regulation-, folding- and secretion- mechanisms. Many expression systems were already tested in the past to increase productivity. It is not only the biotechnological function but also the function as virulence factor in pathogenie microorganism (Stehr et al., 2003) that makes this lipase interesting for scientific work. In this work, a systems-biological approach of heterologous expression in P. putida and homologous expression in P. aeruginosa of the lipase LipA was tested. The methods needed for proteomics and qPCR were established in this work and used for analysis of the expression cultures. The presence of an expression plasmid within P. putida cells obviously causes a stress response, which results in slower growth rate and lower final cell density. Furthermore, after expression of the lipAH operon, the cultures start to produce the siderophore pyoverdine. In this work, for the first time, it was shown that pyoverdinesynthesis requires the production of lipase, either the heterologous LipA or the homologous putative lipases PP4218 which is located within the pyoverdine gene cluster of P. putida. The cellular proteome of P. putida which expressed the heterologous lipase showed differences in proteinexpression of 60 proteins. Among these proteins, an oxidative stress response of bacteria and as expected from the phenotypes some of pyoverdinesynthesis were identified. The analysis of lipase production in P. aeruginosa showed that the lipase also influenced pyoverdine production, although no lipases genes are located in the pyoverdine gene cluster. On one hand, it was shown that no pyoverdine production occurs in a lipAH-negative mutant of P. aeruginosa on the other hand, the alternative sigma factor PvdS which is necessary for pyoverdine production is also down-regulated. This shows for the first time that a lipase influences the transcription of the iron starvation sigma factor encoding gene pvdS. Interestingly the transcription of the lipases was also down-regulated in a pvdS-negative mutant of P. aeruginosa although there is no IS-box present for binding of the PvdS. The transcription of the quorum sensing related genes rhlI/R and lasI/R was also affected in a lipAH mutant of P. aeruginosa. These gene products are needed for autoregulation and synthesis of the signal molecules of the quorum sensing system. Furthermore, no PQS (pseudomonas-quinolon-signal) were detected in the culture supernatant. All these effects can be complemented by expression of the lipase in trans. Rhamnolipids (RL) are QS-regulated secondary metabolite of P. aeruginosa. Indeed no RLs are detectable in the lipAH-mutant of P. aeruginosa, while expression of lipAH in trans resulted in the formation of RL in the P. aeruginosa supernatant. All these findings were summarized by proposing a regulatory network, hypothesis where the activity of LipA generates a putative signal molecule which after signal transduction affects the genes of the QS-system and the pvdS and also PvdS-regulated genes. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.02.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.02.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.10.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.12.2010 |
