Dokument: Der Effekt von Gallensalzen und CD95-Ligand auf Chloridkanäle isolierter Hepatozyten der Ratte

Titel:	Der Effekt von Gallensalzen und CD95-Ligand auf Chloridkanäle isolierter Hepatozyten der Ratte
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17176
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110202-071617-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Funke, Sarah [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.02.2011 / geändert 01.02.2011
Beitragende:	Prof. Dr. med. Häussinger, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Stichwörter:	Apoptose, Hepatozyte, Gallensalze, CD95-Ligand, Chloridkanäle
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Proapoptotische Stimuli wie CD95-Ligand (CD95L) und hydrophobe Gallensalze, z.B. Taurolithocholat (TLCS), induzieren in Hepatozyten innerhalb weniger Sekunden einen Anstieg der intrazellulären Chloridkonzentration ([Clˉ]i), welcher als erstes Ereignis im Apoptose-Signalweg vermutet wird. Welche Ereignisse zur Akkumulation von Chlorid in der Zelle führen, war noch völlig unklar und ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Aus diesem Grunde sollte untersucht werden, i) ob TLCS und CD95L die Chloridleitfähigkeit der Plasmamembran von Hepatozyten so modifizieren können, dass es zu einem Anstieg der intrazellulären Chloridkonzentration kommt, ii) ob TUDC und TC einen Einfluss auf die Chloridleitfähigkeit der Plasmamembran haben und wenn ja, ob und wie sich die Effekte unterscheiden, iii) welche Mechanismen den potentiellen Modifikationen zugrunde liegen und iv) welche Unterschiede sich zwischen TLCS- und CD95L-induziertem Effekt feststellen lassen. Zur Ableitung der Chloridströme über die Plasmamembran isolierter Hepatozyten der Ratte bediente man sich der Patch-Clamp-Technik in der „Whole-Cell“-Konfiguration. Ca2+- und cAMP-abhängige Chloridströme wurden ausgeschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass unstimulierte Hepatozyten eine basal aktive Form des schwellungsaktivierten Chloridstroms, ICl,swell, aufweisen, welcher durch eine Auswärtsgleichrichtung, eine schnelle Aktivierung, eine potentialabhängige Inaktivierung bei Potentialen über +40 mV sowie eine Aktivierung unter hypotonen und eine Reduktion unter hypertonen Bedingungen gekennzeichnet ist. In HEK293 Phoenix-Zellen ist dieser Strom signifikant schwächer. TLCS hemmt reversibel sowohl den basalen wie auch den schwellungsaktivierten Chloridstrom, wobei es nicht zu einer zytoplasmatischen Signaltransduktion kommt, sondern der Effekt über eine Interaktion des Gallensalzes mit extrazellulären Strukturen der Plasmmembran vermittelt wird. Hier ist beispielsweise eine nicht-kompetitive Hemmung der Kanalpore möglich. Weiterhin konnte eine beschleunigte Inaktivierungskinetik gemessen werden, welche vermutlich keine physiologische Bedeutung hat, aber den Effekt auf die beteiligten Chloridkanäle verstärkt. Beide Effekte sind dosisabhängig. Die TLCS-induzierte Hemmung betraf sowohl den Chloridinflux als auch den –efflux. Im Gegensatz zu TLCS hatten TUDC und TC keinen Effekt auf den Chloridausstrom. TUDC hemmt lediglich den Chlorideinstrom in die Zelle. Auch dieser Effekt wurde von der extrazellulären Seite der Plasma-membran und ohne Beteiligung zytoplasmatischer Signaltransduktion vermittelt. Die in der vorliegenden Arbeit präsentierten Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Ruhepotenzial von Hepatozyten negativer als das Gleichgewichtspotenzial von Chlorid ist. Für diese Hypothese müsste Chlorid im Hepatozyten über dem Gleichgewicht verteilt sein. Ein kontinuierlicher Chloridinflux könnte über elektrisch neutrale Transportsysteme, wie den Na+/K+/2Clˉ -Kotransporter, vermittelt werden. Unter Ruhebedingungen käme es somit zu einem kontinuierlichen Chloridefflux. Die TLCS-induzierte Hemmung dieses Ausstroms könnte somit zur Akkumulation von Chlorid in der Zelle führen. CD95L hatte eine Aktivierung des basalen Chloridstroms zur Folge, der einer, wahrscheinlich Caspase-8-abhängigen, zytoplasmatischen Signaltransduktion unterliegt. Eine Depolarisation der Plasmamembran, über die Aktivierung von Kationenkanälen oder –transportsystemen (z.B. Na+/H+-Austauscher) und der darauf folgende Clˉ-Influx, über die nun aktivierten Chloridkanäle, sind als Auslöser für die CD95L-induzierte Chloridakkumulation in der Zelle wahrscheinlich. Somit unterscheiden sich TLCS- und CD95L-induzierter Anstieg der [Clˉ]i klar in ihren Mechanismen, münden aber letztlich in den gleichen Apoptose-Signalweg. In hepatocytes, proapoptotic stimuli such as CD95 ligand (CD95L) and hydrophobic bile acids, e.g. taurolithocholylsulfate (TLCS), lead within seconds to an increase of the cytosolic chloride concentration ([Clˉ]i), which is thought to be the initial trigger for CD95-dependent apoptosis pathway. The bile salts Taurocholate (TC) and tauroursodeoxycholate (TUDC) do not increase [Clˉ]i. The upstream events leading to the accumulation of chloride within the cell are still unknown. The aim of the present study was to investigate i) if the TLCS- and CD95L-induced cytosolic chloride increase is due to a modification of the plasma membrane chloride conductance, ii) if TUDC and TC have an effect on the plasma membrane chloride conductance, and if and how it can be distinguished from those given by TLCS, iii) which are the mechanisms underlying the potential modifications on the chloride flux and iv) if there are differences in the TLCS- and CD95L-induced effect. Therefore patch-clamp experiments in the whole-cell configuration were performed. The hepatocytes used in this study were freshly isolated from male rats and hold in primary cell culture. Unstimulated hepatocytes exhibit under isotonic conditions a basal form of the swelling-activated chloride current, ICl,swell. This current is characterized by an outward rectification, a fast activation, a potential-dependent inactivation at potentials more positive than +40 mV, it becomes activated by hypotonic conditions and inhibited by hypertonic conditions, respectively. In HEK293Phoenix cells, a human renal cell line, this current was significantly weaker under isotonic conditions. TLCS was able to inhibit the basal as well as the swelling-activated chloride current in a reversible manner, with a maximum inhibition already after 5 minutes. Additionally, an acceleration of the potential-dependent inactivation was detected, but we suppose that this effect has no physiological relevance, but supports the presence of the effect by TLCS. Both effects were dose-dependent. The current inhibition was detectable at positive as well as at negative membrane potentials, representing the influx and efflux of chloride, respectively. In contrast, the antiapoptotic bile acid TUDC only inhibited the chloride influx. Interestingly, the bile acids achieve their effects from the extracellular side of the plasma membrane without requirement of any cytoplasmatic signal transduction. As an example, a non-competitive inhibition without pass-over of the bile acid could cause this effect. TC, a bile acid which do not effect apoptosis in hepatocytes, did not affect the basal chloride current in our experiments. Our data could be easily explained postulating that in hepatocytes the resting membrane potential is more negative than the reversal potential of chloride. For this hypothesis chloride have to be distributed above the equilibrium. Therefore, there would be an efflux of chloride under resting conditions. Hence, an inhibition of the efflux by TLCS could lead to an accumulation of chloride within the cell. A continuous entrance of chloride into the cell could be realized by electro neutral transport systems, such as the Na+/K+/2Clˉ cotransporter. Furthermore, a chloride channel-independent mechanism is possible. The death ligand CD95L activates the basal chloride current. As expected for a receptor-binding ligand, CD95L affects the current only when signal transduction could occur. It is very likely that an caspase-dependent depolarisation of the plasmamembrane due to modifications of cation channels or transporter systems, such as the Na+/H+-exchanger, with simultaneous activation of chloride channels, as observed in this study, leads to an anhanced influx of chloride. Therefore, the TLCS- and CD95L-induced increase of the cytosolic chloride concentration underlies different mechanisms that finally lead into the same apoptosis pathway.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	02.02.2011
Dateien geändert am:	02.02.2011
Promotionsantrag am:	29.09.2010
Datum der Promotion:	11.01.2011