Dokument: Optimierung der Penicillinacylase Produktion und Charakterisierung einer neuen, biotechnologisch relevanten β-Peptidyl Aminopeptidase BapF aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Optimierung der Penicillinacylase Produktion und Charakterisierung einer neuen, biotechnologisch relevanten β-Peptidyl Aminopeptidase BapF aus Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17116
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110126-105846-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Fuchs, Viola [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.01.2011 / geändert 25.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Penicillinacylase, β-Peptidyl Aminopeptidase, Pseudomonas aeruginosa
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Serinproteasen stellen eine große Gruppe innerhalb der Proteasen dar, die in der Industrie immer mehr an Bedeutung gewinnt. Die Verwendung von Enzymen in der Industrie ermöglicht es chemische Prozesse durch biokatalytische Verfahren zu ersetzen, und somit ökologisch und ökonomisch nachhaltiger durchzuführen. Die Synthese vieler industriell genutzter Enzyme verläuft jedoch oft nicht zufriedenstellend. Die zu den Serinproteasen gehörenden Penicillinacylasen sind bedeutende Schlüsselenzyme für die industrielle Herstellung von Antibiotika. Daher ist die Produktion dieser Enzyme im großen Maßstab von hohem Interesse. Die Penicillin G Acylase (PGA) aus Escherichia coli ATCC 11105 wird schon lange in industriellen Prozessen für die Herstellung von semisynthetischen β-Laktam-Antibiotika verwendet. Die Produktion von PGA ist jedoch durch die Akkumulation von PGA-Vorstufen limitiert. Die Synthese von PGA könnte durch die Koexpression von Chaperonen verbessert werden. PGA wurde als Modellenzym ausgewählt, um mithilfe der vorhandenen Chaperongenexpressions-Bibliothek aus P. aeruginosa die bestmöglichen Chaperone zu identifizieren, die die Synthese großer Mengen dieser Enzymklasse ermöglichen. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch die Koexpression der Chaperongene hscB, pa2725 und csaA aus P. aeruginosa die spezifische Aktivität der PGA deutlich gesteigert werden kann. Die noch wenig bekannten β-Peptidyl Aminopeptidasen aus der Familie der Serinproteasen sind die ersten bekannten Enzyme, die β-Peptide und β-aminosäurehaltige Peptide hydrolysieren können. Aufgrund ihres einzigartigen Substratspektrums und ihrer ungewöhnlichen Proteinfaltung werden diese Enzyme in die neue Proteasefamilie S58 in der MEROPS Datenbank eingeordnet. Die physiologische Funktion dieser Enzyme war nicht bekannt. Das opportunistisch humanpathogene Bakterium P. aeruginosa besitzt eine Vielzahl von Proteasen, von denen beschrieben ist, dass sie bei der Ausprägung der Virulenz und der Etablierung von Infektionen eine entscheidende Rolle spielen. Durch Sequenzvergleiche mit den bekannten β-Peptidyl Aminopeptidasen konnte im Rahmen dieser Arbeit im Genom von P. aeruginosa PAO1 ein offener Leserahmen, pa1486 (bapF), identifiziert werden, der Sequenz-ähnlichkeiten zu β-Peptidyl Aminopeptidasen zeigt. In dieser Arbeit wurde das entsprechende Protein BapF genannt und in P. aeruginosa erstmals physiologisch und biochemisch charakterisiert. Es wurde postuliert, dass β-Peptidyl Aminopeptidasen für die Virulenz von humanpathogenen Bakterien eine Rolle spielen könnten. Um die physiologische Bedeutung dieser Enzyme in vivo zu untersuchen, wurden β-Peptidyl Aminopeptidase-negative P. aeruginosa Stämme konstruiert und verschiedene Phänotypen untersucht. Es zeigten sich jedoch keine signifikanten Unterschiede. Auch in einem gut etablierten Virulenzmodell der Maus konnte durch die Deletion des β-Peptidyl Aminopeptidasegens in P. aeruginosa keine signifikante Reduktion der Virulenz detektiert werden. Für das Gen bapF wurde gezeigt, dass es zusammen mit pa1485 in einem funktionellen Operon im Chromosom von P. aeruginosa lokalisiert ist. Das Protein PA1485 ist ein putativer Aminosäuretransporter, und könnte für den Transport der Substrate von BapF ins Cytoplasma verantwortlich sein. Zur Untersuchung der physiologischen Funktion wurde eine pa1485-negative Mutante in P. aeruginosa konstruiert und die Aufnahme verschiedener Substrate (z. B. Carnosin und Carcinin) getestet. Jedoch zeigte sich, dass PA1485 nicht, oder nicht einzig für den Import von Carnosin als Substrat von BapF verantwortlich ist. Das Enzym BapF konnte erstmals im heterologen Wirt E. coli BL21(DE3) aktiv exprimiert und anschließend über Säulenchromatographie isoliert werden. Das Substratspektrum von BapF zeigt, dass es spezifisch Substrate hydrolysiert, die am N-Terminus ein β-Alanin aufweisen. Das pH-Optimum von BapF liegt bei 5,5 und das Temperaturoptimum bei 37°C. Durch Größenaus-schlusschromatographie konnte gezeigt werden, dass BapF eine molekulare Masse von 140 kDa besitzt und das aktive Enzym ein (αβ)4-Homotetramer ist. Zusammengefasst konnte für BapF aus P. aeruginosa erstmals gezeigt werden, dass es sich um eine β-Peptidyl Aminopeptidase handelt. Serine proteases are one of the most abundant groups of proteolytic enzymes, which become more important in industrial processes. The use of enzymes in industry offers the possibility to replace chemical reactions by biocatalytic processes and thus contribute to the environmental sustainability. However, the synthesis of many industrially used enzymes is often limited by low levels of expression. Penicillin acylases, which belong to the family of serine proteases, are important key enzymes for the industrial production of antibiotics and thus high-level production of these enzymes is of great interest. Penicillin G acylase (PGA) derived from Escherichia coli ATCC11105 has been used in industrial processes for the production of semisynthetic β-lactam antibiotics for a long time. But the production of PGA was limited by the accumulation of PGA precursors. The synthesis of PGA could be improved by chaperone coexpression. PGA was used as a model enzyme to identify the best possible chaperone for enhancing the production of this enzyme class by use of a Pseudomonas aeruginosa chaperone expression library. It was shown that coexpression of the chaperone genes hscB, pa2725 and csaA from P. aeruginosa can increase PGA activity. β-peptidyl aminopeptidases are serine proteases which hydrolyse a variety of short β-peptides and β-amino acid containing peptides. Based on their unique substrate spectrum and unusual protein folding they are classified into the novel peptidase family S58 according to the MEROPS database. The physiological role of these enzymes still remains unclear. The opportunistic human pathogen P. aeruginosa possesses a variety of different proteases most of which have been described to contribute to virulence and the establishment of P. aeruginosa infections. By homology search using known β-peptidyl aminopeptidase sequences, an open reading frame, pa1486 (bapF), was identified in the genome of P. aeruginosa PAO1. In this work, the biochemical properties and the physiological role of BapF from P. aeruginosa were investigated. It was postulated that β-peptidyl aminopeptidases are involved in the virulence phenotype of human pathogenic bacteria. To determine the physiological role of these enzymes in vivo, β-peptidyl aminopeptidase-negative strains of P. aeruginosa were constructed. Several phenotypes were analyzed, but under the chosen conditions there are no detectable differences between the mutant strain and the wildtype. However, by the use of a well-established mouse infection model no significant differences in virulence phenotype were detectable. It was proven that the bapF gene is localized with pa1485 in an operon on the chromosome of P. aeruginosa. The protein PA1485 is a putative amino acid permease that could be responsible for the import of substrates for BapF. To analyze its physiological function, a pa1485 deletion mutant of P. aeruginosa was created and the uptake or utilization of several substrates (e. g. carnosine and carcinine) was tested. The results demonstrated that PA1485 was not the (only) transporter for the analysed substrates of BapF. BapF was functionally expressed in E. coli BL21(DE3) and purified using column chromatography. BapF was found to hydrolyse peptides and amides containing an N-terminal β-alanine. The enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and its temperature optimum is at 37°C. According to size exclusion chromatography, the native molecular mass of BapF was about 140 kDa indicating that the enzyme forms a (αβ)4-homotetramer. The results clearly show that BapF from P. aeruginosa is a β-peptidyl aminopeptidase.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	26.01.2011
Dateien geändert am:	26.01.2011
Promotionsantrag am:	18.10.2010
Datum der Promotion:	09.12.2010