Dokument: Untersuchungen zur Bildung von D-Aminosäuren mit Corynebacterium glutamicum

Titel:Untersuchungen zur Bildung von D-Aminosäuren mit Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:Analysis for the production of D-amino acids with Corynebacterium glutamicum
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20110124-103638-1
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Stäbler, Norma Christine [Autor]
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Dateien vom 20.01.2011 / geändert 20.01.2011
Beitragende:Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Stichwörter:D-Aminosäure, Biotechnologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Obwohl sie in der Natur relativ selten vorkommen, spielen D-Aminosäuren für die Industrie, zum Beispiel zur Synthese von Antibiotika und anderen Pharmazeutika, eine große Rolle. Im Gegensatz zu den L-Aminosäuren, die im Wesentlichen fermentativ aus Zuckern gewonnen werden, sind die Produktionswege für D-Aminosäuren durch die Kombinationen enzymatischer und chemischer Schritte aufwendig und kostenintensiv. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das Potential von Corynebacterium glutamicum zur Bildung von D-Aminosäuren untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
(1) Die Zugabe von 100 mM der D-Aminosäuren D-Threonin, D-Lysin, D-Arginin, D-Alanin, D Serin, D-Asparagin oder D-Methionin führte nur zu einer geringen Reduktion der Wachstumsrate. Ein Abbau konnte nur für D-Alanin und D-Serin festgestellt werden.
(2) Die Racemase ArgR aus Pseudomonas taetrolens war bei Bildung einer um das N terminale Signalpeptid verkürzten Variante in C. glutamicum cytoplasmatisch lokalisiert und zeigte sowohl mit Lysin, Arginin und Ornithin als auch mit Serin als Substrat Aktivität.
(3) Die Expression von argR in einem L-Serin-Produktionsstamm von C. glutamicum führte überraschenderweise zur Bildung eines Überschusses von D- gegenüber L-Serin. Nach 120 Stunden Fermentation wurden dabei 81 mM D- und 26 mM L-Serin gebildet. Zusätzlich erhöhte sich die Gesamt-Serinausbeute um 50 %.
(4) Im Gegensatz dazu führte die Expression von argR in einem L-Lysin-, L-Arginin- oder L Ornithin-Produktionsstamm zur Bildung äquimolarer Mischungen der jeweiligen Enantiomere. Dabei wurden, in Abhängigkeit von der Produktionskapazität der Ausgangsstämme, 29 mM D Lysin, 3 mM D-Arginin und 48 mM D-Ornithin gebildet.
(5) D-Aminosäuren wie D-Serin, D-Lysin, D-Arginin und D-Ornithin wurden aus den Zellen von C. glutamicum exportiert. Über Dipeptid-Experimente konnte dabei der spezifische Lysin-Transporter LysE als Exporter von D-Lysin identifiziert werden. Die Affinitäten für beide Enantiomere schienen vergleichbar. Im Gegensatz dazu wurde D-Serin mit einer Exportrate von 16 nmol min-1 (mg TG)-1 mehr als doppelt so schnell exportiert als das entsprechende L Enantiomer, was auf einen spezifischen Exporter hinweist.
(6) LysG, der Transkriptionsregulator von lysE, bildet in Lösung ein Tetramer und bindet an ein 88 bp-großes Fragment im intergenischen Bereich von lysE und lysG. Die Messung der intrinsischen Proteinfluoreszenz deutet an, dass beide Enantiomer von Lysin als Effektoren von LysG dienen können.
Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass Bakterien auch direkt zur Produktion von D Aminosäuren aus Zuckern eingesetzt werden können, und dass über die Beeinflussung des Exports extrazellulär möglicherweise sogar bevorzugt die Akkumulation des D-Enantiomers möglich ist.

Although rare in nature, D-amino acids are of great importance for industry as they serve as building blocks for the synthesis of antibiotics and pharmaceuticals. In contrast to L amino acids, which are produced mostly via fermentation from sugars, almost all processes for D-amino acid production combine chemical and enzymatical steps and therefore are both extensive and expensive. Consequently, the main objective of this study was to analyse the potential of Corynebacterium glutamicum, which is an important organism in white biotechnology, to produce D-amino acids. This yielded the following results:
(1) The addition of 100 mM D-threonine, D-lysine, D-arginine, D-alanine, D-serine, D-asparagine or D-methionine led to only a slight reduction in the growth rate of C. glutamicum. Degradation could be observed for D-alanine and D-serine only.
(2) The racemase ArgR from Pseudomonas taetrolens was shown to be localized in the cytoplasm of C. glutamicum when expressed without the N-terminal signal peptide. The enzyme is active with the substrates lysine, arginine and ornithine as well as with serine.
(3) Surprisingly, expression of argR in an L-serine producing strain led to the formation of an excess of D-serine compared to L-serine. After 120 hours of fermentation 81 mM D- and 26 mM L-serine accumulated in the supernatant of the culture. Furthermore the total serine yield was extended to 150 %.
(4) In contrast, expression of argR in an L-lysine, L-arginine or L-ornithine producing strain led to the formation of equimolar mixtures of both enantiomers. According to the production capacity of the initial strains, 29 mM D-lysine, 3 mM D-arginine and 48 mM D ornithine were produced.
(5) It is evident that D-serine, D-lysine, D-arginine and D-ornithine are excreted by C. glutamicum. For D-lysine the basic amino acid transporter LysE could be shown to participate in export and both enantiomers seem to be exported with comparable affinities. Nevertheless, with an export rate of 16 nmol min-1 (mg TG)-1 D-serine was excreted at a 2-fold increased rate although the cytosolic concentrations of D- and L-serine were almost identical. This suggests the existence of a specific exporter.
(6) LysG, the transcriptional regulator of lysE, is a tetramer in solution and binds to an 88 bp fragment in the intergenic region of lysE and lysG. As determined by fluorescence spectroscopy LysG accepts both enantiomers of lysine as coinducers.
Therefore, for the first time it could be demonstrated that bacteria can be used for the production of D-amino acids from cheap precursors like sugars. Additionally, the preferential extracellular accumulation of the D-enantiomer seems to be possible by engineering the export of the specific enantiomer
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:24.01.2011
Dateien geändert am:24.01.2011
Promotionsantrag am:12.10.2010
Datum der Promotion:12.11.2010
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