Dokument: Studies on ABC Transporters from Human Liver in Heterologous Expression Systems

Titel:Studies on ABC Transporters from Human Liver in Heterologous Expression Systems
Weiterer Titel:Studien an ABC Transportern der humanen Leber in heterologen Expressionssystemen
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17058
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20110120-114915-6
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor:Dr. Stindt, Jan [Autor]
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Dateien vom 17.01.2011 / geändert 17.01.2011
Beitragende:Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater]
PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:ABC transporter, heterologous expression, unstable DNA,
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Die physiologische Funktion kanalikulärer Transportsysteme in der menschlichen Leber ist heute klar definiert. Die Mehrheit der beteiligten Membranproteine gehören zur Familie der ATP-Bindekassette (ABC)-Transporter und vermitteln den primär-aktiven Transport ihrer Substrate unter ATP-Hydrolyse. Auf molekularer Ebene sind die Beziehungen zwischen Mutationen in diesen Membranproteinen und den damit assoziierten Krankheiten noch weitgehend unverstanden. In vivo-Systeme sind für die Untersuchung vieler Fragestellungen auf molekularer Ebene ungeeignet. Um mechanistische Einblicke in die Funktionsweise von Wildtyp als auch mutierten Transportern zu erlangen, werden in vitro-Systeme benötigt.
Ziel dieser Doktoarbeit war, geeignete in vitro-Systeme für humane ABC-Transporter bereitzustellen, die in der kanalikulären Membran der Hepatozyten lokalisiert sind. Die Gallensalzexportpumpe (BSEP, ABCB11) und das Multidrogenresistenzprotein 3 (MDR3, ABCB4) nehmen wichtige Rollen bei der Sekretion von Gallenbestandteilen ein. Ihre Fehlfunktion ist mit schweren erblichen Erkrankungen wie der Progressiven Familiären Intrahepatischen Cholestase (PFIC) Typ 2 und 3 verbunden. Ihre heterologe Überexpression ist eine wichtige Voraussetzung für in vitro-Studien, da Membranproteine recht instabil sind und in ihrem nativem Gewebe oft nur in geringer Menge vorkommen. Im Gegensatz zu Säugetierzellkultur sind die beiden Hefen Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris leicht handzuhabende und gut charakterisierte Expressionssysteme für Membranproteine. Eine Herausforderung in bezug auf BSEP und MDR3 ist die Instabilität der kodierenden DNS-Sequenzen in Escherichia coli, die in vorherigen Studien ein limitierender Faktor war. Speziell Studien an Transportermutationen gestalten sich schwierig, da die Mutagenese der kodierenden Sequenzen stark erschwert ist. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit können wie folgt zusammengefaßt werden:
I) Die erstmalige heterologe Expression von BSEP und MDR3 in Bäckerhefe gelang sowohl chromosomal als auch plasmidgebunden. Da hier die Expression von BSEP nur sehr gering war, wurde ein Expressionstest verschiedener Promotoren durchgeführt, der zu keiner Expressions- steigerung führte. Der Zusatz von Glycerin, einem kompatiblen Osmolyten, zu den Hefekulturen bewirkte eine zweifache Expressionssteigerung von BSEP. Glycerin diente hier als eine chemische Faltungshilfe. Für MDR3 wurde gezeigt, daß die Position des Histidin-Affinitätsanhängsels die Expression signifikant beeinflußte.
II) Ein carboxyterminal mit einem Histidin-Affinitätsanhängsel fusioniertes MDR3 konnte in Bäckerhefe in Mengen exprimiert werden, die mit denen hier für humanes MDR1 erzielten vergleichbar sind. MDR3 konnte mit Detergenzien solubilisiert und anschließend in Mengen aufgereinigt werden, die erstmalig die Detektion auf einem mit Coomassie-Farbstoff gefärbten SDS-Proteingel ermöglichten.
III) Die Ausbeute an rekombinantem BSEP konnte durch Wechsel des Expressionssystems von der Bäckerhefe auf die methylotrophe Hefe Pichia pastoris deutlich erhöht werden. Aus diesem kann BSEP jetzt in präparativen Mengen solubilisiert und aufgereinigt werden.
IV) Zur Etablierung der Expression in beiden Hefesystemen wurde ein kompletter Arbeitsablauf realisiert, der die Klonierung der instabilen kodierenden DNS-Sequenzen von BSEP und MDR3 ohne E. coli ermöglicht. Die Strategie macht sich stattdessen die effiziente Maschinerie von S. cerevisiae zur homologen Rekombination von DNS-Sequenzen zunutze. Der Arbeitsablauf beinhalted außerdem eine neue Methode zur zielgerichteten DNS-Mutagenese, die ebenfalls ohne E. coli funktioniert und die schnelle Herstellung klinisch relevanter BSEP- und MDR3-Mutationen sowohl in Säugetierzellkulur
als auch in den Hefeexpressionssystemen ermöglicht. Dieses war bisher sehr zeitaufwendig, da die Einführung von Mutationen auf DNS-Ebene regelmäßig zu zufälligen Deletionen in den Konstrukten führte.
Aufgrund dieser Arbeit können klinisch relevante Mutationen in beiden Transportproteinen nun ungleich schneller und leichter realisiert werden, und diverse BSEP-Varianten werden derzeit sowohl in Zellkultur als auch in vitro untersucht.

Today, the physiological function of canalicular export systems of the human liver in detoxification, bile generation and secretion is clearly defined. Most membrane proteins taking part in this function are members of the ATP binding cassette (ABC) transporter family and perform primary active substrate transport energized by ATP hydrolysis. On a molecular level, little knowledge exists about the relation between mutations in these membrane proteins and the diseases they are associated with. Convenient in vivo systems are limited and cannot answer many questions of molecular function. To gain mechanistic insights into both wild type and mutated transporters, in vitro systems are indispensible that are of a very limited availability.
The aim of this thesis was to establish suitable in vitro systems for human ABC transporters that are expressed in the apical membrane of polarized hepatocytes. Here, the human bile salt export pump (BSEP, ABCB11) and the multidrug resistance protein 3 (MDR3, ABCB4) play an important role in bile secretion, and their malfunction is associated with severe hereditary diseases like Progressive Hereditary Intrahepatic Cholestasis (PFIC) type 2 and 3. Heterologous overexpression is a vital necessity for in vitro studies, because membrane proteins, especially those from human, are quite unstable and of rather low abundance in their native tissue. In contrast to mammalian cell culture, the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris provide comparatively easy and well- characterized expression systems for polytopic membrane proteins. A challenge associated with BSEP and MDR3 is the instability of their coding sequences in Escherichia coli that has been a strong limiting factor in previous studies on both, and especially on clinically relevant mutations in these, as the latter are not easily generated. The results of this thesis can be summarized as follows:
I) The first-time heterologous expression in S. cerevisiae yeast of both human BSEP and MDR3 was achieved, both chromosomally and from plasmid. For the low-expressing BSEP, an expression screen was devised that did not lead to an improved expression. The compatible osmolyte glycerol was found to function as a chemical chaperone for BSEP, leading to an estimated twofold increase in expression. For MDR3 it was found that the his tag position had a dramatic impact on expression levels.
II) In S. cerevisiae, the C-terminally his-tagged MDR3 could be expressed at a level comparable to MDR1 which yields milligram amounts per litre of culture. Human MDR3 could be detergent- solubilized and purified to amounts that for the first time allowed its detection on a Coomassie-stained SDS-PAGE gel.
III) The yield of BSEP could be improved substantially by switching the expression host from S. cerevisiae to P. pastoris.
IV) In order to establish expression in both yeast systems, a complete workflow was designed and implemented that allows the cloning of the unstable BSEP and MDR3 coding sequences without the use of E. coli. Instead, the cloning strategy can completely rely on the powerful homologous recombination machinery of S. cerevisiae. The workflow includes a new site-directed mutagenesis procedure that is also independent of E. coli usage and enables the rapid recreation of clinically relevant BSEP and MDR3 mutations in both mammalian cell culture and the yeast expression systems. This has previously been a complicated and time-consuming procedure as the attempt to introduce targeted mutations regularly led to random deletions within the constructs.
As a result of this work, clinically relevant mutants of BSEP and MDR3 are now generated much faster, and several BSEP variants are currently being studied in mammalian cell culture and in vitro.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:20.01.2011
Dateien geändert am:20.01.2011
Promotionsantrag am:21.10.2010
Datum der Promotion:13.12.2010
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