Dokument: Isoform-spezifische Funktionen der Proteinkinase Akt in Kardiomyozyten

Titel:	Isoform-spezifische Funktionen der Proteinkinase Akt in Kardiomyozyten
Weiterer Titel:	Isoform-specific functions of protein kinase Akt in cardiomyocytes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17057
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110120-115532-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Raupach, Annika [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,66 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.01.2011 / geändert 18.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Proteinkinase B (Akt) ist eine zentrale Schnittstelle intrazellulärer Signaltransduktion. Nach Aktivierung über den Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase-Signalweg beeinflusst sie zelluläres Wachstum, Apoptose und Metabolismus. In Säugern findet man drei Akt-Isoformen, die trotz hoher Homologie unterschiedliche Funktionen besitzen. Im Herzen werden hauptsächlich die beiden stark homologen Isoformen Akt1 und Akt2 exprimiert, deren spezifische Eigenschaften und Funktionen in Kardiomyozyten wenig erforscht sind. Zur Untersuchung dieser Isoform-spezifischen Funktionen wurden von der heart-like-1 (HL-1) Kardiomyozyten Zelllinie stabile Knock Down Zelllinien für Akt1 und Akt2 mittels RNA Interferenz generiert. Mit diesen Zelllinien konnten erstmals relative Proteinspiegel der beiden Isoformen gemessen werden. Akt1 stellt mit 75 % der gesamten Akt Proteinmenge die quantitativ dominante Isoform über Akt2 mit 25 % in Kardiomyozyten dar. Obwohl Akt2 die geringer exprimierte Isoform repräsentiert, wird sie nach Stimulation mit Insulin und IGF bevorzugt phosphoryliert. Die Phosphorylierung des Akt Substrats Glykogensynthase 3 β wurde durch den Knock Down der jeweiligen Isoform gleichermaßen reduziert und stellt somit für beide Isoformen ein Substrat dar. Die Proliferationsrate der Zellen wurde durch den Knock Down nicht beeinflusst. Da bekannt ist, dass Akt und im Besonderen Akt2, den Glukosemetabolismus reguliert, wurde untersucht, ob es zur Modulation von Faktoren der Glukoseaufnahme durch spezifische Akt Isoenzyme kommt. Nur der Verlust von Akt2 reduzierte die Proteinspiegel der Glukosetransporter GLUT1 und GLUT4, wobei die Expression der mRNA unverändert blieb. An Zelllinien, die stabil Akt1 bzw. Akt2 überexprimieren oder von Knock Down Zelllinien, in denen der Verlust der jeweiligen Isoform durch Expression mutagenisierter und somit shRNA resistenter Akt Isoformen rückgängig gemacht wurde, konnte gezeigt werden, dass die GLUT1 und GLUT4 Proteinspiegel durch Akt2 und nicht durch Akt 1 bestimmt wurden. Das akt substrate of 160 kDa (AS160), welches die Translokation des GLUT4 an die Plasmamembran moduliert, zeigte ebenfalls nur bei Verlust von Akt2 eine Reduktion der Proteinmenge. Die verringerte Proteinexpression der Glukosetransporter und AS160 führte nicht zu einer Veränderung der Glukoseaufnahme in Kardiomyozyten. Zur Identifizierung neuer Akt-Isoform-spezifischer Signaltransduktion wurde mit Hilfe der Knock Down Zelllinien und einer dreifachen Formaldehymarkierung eine quantitative Phosphoproteom-Analyse durchgeführt. Mit dieser Analyse konnten mittels nano-LC-ESI-MS insgesamt 113 Phosphopeptide identifiziert werden, von denen sechzehn Phosphopeptide ein unterschiedliches Phosphorylierungsniveau durch den Verlust der Akt-Isoformen aufwiesen. Hierbei wurden vor allem in Akt2 Knock Down Zellen neue Akt Substrate identifiziert, von denen mehrere im Zusammenhang mit dem intrazellulären Vesikeltransport standen. Für weiterführende in vivo Untersuchungen wurde die Generierung einer herzspezifischen, konditionalen Akt1 Knock Out Maus bis zu der Erzeugung der Chimären vorangetrieben. Mit Hilfe dieses Mausmodells sollen Isoform-spezifische Funktionen in vivo untersucht und die Rolle der Akt-Isoformen in der Hypertrophieentwicklung aufgeklärt werden. Schlussfolgerung: Akt2 ist in Kardiomyozyten trotz geringerer Expression nach Stimulation mit Insulin die funktionell dominante Akt Isoform. The protein kinase B (Akt) is a central interface of intracellular signal transduction. It is activated by the phosphatidyl-inositol-3-kinase pathway and modulates cellular growth, apoptosis and metabolism. In mammals, three distinct isoforms have been described which despite a high degree of homology exert specific functions. In the heart, Akt1 and Akt2 are expressed, but their specific functions in cardiomyocytes are only poorly understood. To analyse isoform-specific functions, stable Akt1 and Akt2 knock down cell lines were derived from heart-like 1 (HL-1) cardiomyocytes by means of shRNA expression. These knock down cell lines allowed the first time to measure the relative isoform protein levels. Akt1 represented 75 % of total Akt in cardiomyocytes, whereas Akt2 accounted for only 25 % of total Akt. Although Akt2 was the minor isoform, insulin or IGF stimulation resulted primarily in phosphorylation of Akt2. The phosphorylation of the Akt substrate glycogen-synthase 3 β (GSK3β) was evenly reduced in both knock down cell lines, which revealed GSK3β as a substrate of both isoforms. The knock down of Akt-isoforms did not influence cell proliferation rate. Since it is known, that Akt and especially Akt2 regulates glucose metabolism, it was investigated to what extent knock down of Akt isoforms modulated glucose uptake. Only loss of Akt2 reduced the protein levels of glucose transporters GLUT1 and GLUT4, while mRNA expression was unchanged. Cell lines stably over expressing Akt1 or Akt2 as well as knock down cell lines expressing mutated and thereby shRNA resistant Akt isoforms showed that GLUT1 and GLUT4 protein levels were determined by Akt2, but not by Akt1. Protein levels of Akt substrate of 160 kDa (AS160), which modulates GLUT4 translocation to the plasma membrane, were only reduced in cells lacking Akt2. Changes in protein levels of glucose transporters and AS160 did not modify the glucose uptake. To identify novel isoform-specific functions, a quantitative phosphoproteomic approach with a triple formaldehyde labeling was performed by using the knock down cell lines. In total, 113 phosphopeptides were identified by nano-LC-ESI-MS. Sixteen of them showed a different phosphorylation pattern due to loss of one of the Akt isoforms. Interestingly, alterations were mainly detected in Akt2 knock down cells. Several of the identified proteins were linked to intracellular vesicle transport. For in vivo studies, the generation of a cardiac-specific, conditional Akt1 Knock out mouse was performed till the generation of chimeric mice. This model will allow the investigation of isoform-specific functions in vivo and to decipher the role of Akt isoforms in the development of cardiac hypertrophy. Conclusion: Despite a lower expression level Akt2 is the functionally predominant Akt isoform in cardiac myocytes.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie
Dokument erstellt am:	20.01.2011
Dateien geändert am:	20.01.2011
Promotionsantrag am:	12.11.2010
Datum der Promotion:	14.01.2011