Dokument: Synthese gezielt isotopenmarkierter und strukturell modifizierter Tetrapyrrole

Titel:	Synthese gezielt isotopenmarkierter und strukturell modifizierter Tetrapyrrole
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=17001
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110121-101821-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ringsdorf, Simone [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,45 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2011 / geändert 13.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Gärtner, W. [Gutachter] Prof. Dr. Müller, Thomas J. J. [Gutachter]
Stichwörter:	Phytochrome, Biliverdin, Phycocyanobilin
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Phytochrome sind eine Familie von Photorezeptoren, die in nahezu alle höheren Pflanzen, Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Moosen vorkommen. Der Photorezeptor besteht aus einem chromophortragenden Protein, das als optischer Schalter fungiert. Möglich wird dies durch die zwei thermisch stabilen Zuständen, meist Pr (r = red absorbing/ rotes Licht absorbierend) und Pfr (fr = far red absorbing/ dunkelrotes Licht absorbierend), in denen der Photorezeptor vorliegt. Die Absorption von rotem Licht führt zur Z/E-Isomerisierung des gebundenen Chromophors, bei dem es sich um ein offenkettiges Tetrapyrrol handelt, das über eine Thioether-Brücke an ein Cystein des Proteins gebunden ist. Bisher konnten drei verschiedene Chromophore in Phytochromen identifiziert werden: Phytochromobilin (PΦB) (2), Phycocyanobilin (3) und Biliverdin (BV) (1). Die lichtinduzierte Isomerisierung des Chromophors erfolgt an der C15-16-Doppelbindung des D-Rings, der dadurch aus der Z- in die E-Konformation übergeht. Die Isomerisierung ist reversibel und wird durch die Absorption von dunkelrotem Licht wieder umgekehrt. In Pflanzen steuert das Phytochrom eine Vielzahl von morphologischen Prozessen, wie die Keimung, Blütenbildung und die circadiane Rhythmik. Die Aufgabe der Phytochrome in anderen Organismen ist noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl 13C- und 15N-markierte als auch strukturell modifizierte Tetrapyrrole für schwingungsspektroskopische und kernspinresonanzspek-troskopische Messungen an Cph1 und PhyA dargestellt. Die Synthese der Tetrapyrrole erfolgte durch Totalsynthese und durch Extraktion aus dem Cyanobakterium Spirulina platensis mit anschließender Modifizierung. Die Totalsynthese folgte dem „klassischen“ Syntheseprinzip nach Gossauer, bei dem die Pyrrolringe zunächst einzeln aufgebaut, dann zur AB- und CD-Hälfte zusammengesetzt und schließlich zum Tetrapyrrol kondensiert werden. Zur Darstellung der gezielt isotopenmarkierten Chromophore erwies sich der in der Arbeitsgruppe etablierten Reaktionsweg in den meisten Fällen als ungeeignet, sodass abhängig von der jeweiligen Isotopenmarkierung und der Isotopenquelle neue Synthesekonzepte entwickelt wurden. Für die Darstellung von (22-15N)-Phycocyanobilin wurde, soweit bekannt, erstmalig ein Syntheseweg ausgehend von 15N-Glycin entwickelt. Dieser Baustein wurde über drei Stufen zum Isonitril und dann zum C-Ring umgesetzt. Für die Synthese von (123-13C)-Phycocyanobilin wurde eine Synthesefolge basierend auf (13C)-Natriumcyanid und 3-Brompropionaldehyddimethylacetal entwickelt, die innerhalb von vier Schritten zum 4-Acetoxy-5-nitrohexansäuremethylester und dann zum C-Ring führt. Es wurden zwei Phycocyanobiline mit jeweils einer 13C-Isotopenmarkierung in den beiden äußeren Methinbrücken (C5 und C15) dargestellt. Als Isotopenquelle diente im Fall des (5-13C)-PCBs (2-13C)-2-Bromessigsäure und für das (15-13C)-PCB N,N-Dimethylformamid-(Carbonyl-13C). Die Synthese wurde für die spätere Assemblierung ins jeweilige Protein bis zur Freisetzung der Disäure durchgeführt. Die markierten Chromophore wurden in Cph1 und PhyA assembliert und schwingungsspektroskopisch untersucht. Das (15-13C)-PCB wurde ebenfalls in Kooperation mit den Arbeitsgruppen von P. Hildebrandt und M.A. Mroginski (Berlin) in PhyA und Cph1 assembliert und ermöglichte die Zuordnung des C15-Signals im Ramanspektrum. Zusammen mit simulierten Ramanspektren, die mit einer neuen QM/MM-Hybridmethode berechnet wurden, konnte die kristallographisch ermittelte ZZZssa-Konformation des Chromophors im Pr-Zustand des Photoreceptors und die ZZEssa-Konformation des Pfr-Zustands verifiziert werden (noch nicht publiziert). Das (15-13C)-PCB wurde zudem in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von C. Lagarias (Davies, USA) und R.A. Mathies (Berkeley, USA) ebenfalls in Cph1 assembliert und mit Femtosekunden Ramanspektroskopischen Methoden untersucht. Die Messungen der nichtplanaren Biegeschwingung des Wasserstoffs der CD-Methinbrücke ist ein starkes Indiz für die Z/E-Isomerisierung des D-Rings, was die neu aufgekommene Vermutung der Isomerisierung des A-Rings widerlegt. Neben den isotopenmarkierten Phycocyanobilinen wurde Phycocyanobilin aus dem Cyanobakterium Spirulina platensis isoliert. Die während der Methanolyse zusätzlich entstehenden Methanoladdukte wurden abgetrennt und charakterisiert. Darauf folgende kernspinresonanzspektroskopische Messungen sollten zur genaueren Bestimmung der Methanoladdukte führen. Anschließend wurde das isolierte PCB für kernspinresonanzspektroskopische Messungen zu einem 31-Cysteinaddukt umgesetzt. Das isolierte PCB wurde zudem nach der Methode von Manitto und Monti mittels Thiobarbitursäure gespalten und die erhaltenen Spalthälften charakterisiert. Als zweiter in den nativen Phytochromen vorkommender Chromophor wurde Biliverdin IXα durch Oxidation von Bilirubin dargestellt. Durch Spaltung des Chromophors und anschließendes Wiederzusammensetzen unter Einführung einer Isotopenmarkierung in der neu entstehenden Brücke wurde (10-13C)-Biliverdin IXα synthetisiert. Das (10-13C)-Biliverdin IXα wurde in Agp1 und CphB assembliert und ebenfalls in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von P. Hildebrandt (Berlin) schwingungsspektroskopischen Methoden unterzogen. Die 13C-Markierung führte zur Aufspaltung des normalerweise breiten Methinbrückensignals und ermöglichte so die Identifizierung des Signals der mittleren Methinbrücke (noch nicht publiziert). Phytochromes form a class of ubiquitous photoreceptors occurring in higher plants, bacteria, cyanobacteria, fungi and mosses. The photoreceptor is constituted as a Chromophore-bearing protein that acts as an optical switch. Photoswitching occurs between two thermal stable states Pr (red absorbing) and Pfr (far red absorbing) of the receptor. Absorption of red light induces a Z/E isomerization of the 15-16 double bond of the bilin chromophore. The chromophore is attached to a cysteine residue of the protein via a thio-ether linkage. Three different types of chromophores have been identified in phytochromes: phytochromobilin (PΦB) (2), phycocyanobilin (PCB) (3) and biliverdin (BV) (1). Light induced isomerization takes place at the D-ring 15-16 double bond by which the chromophore is converted from its Z- to the E-conformer. Absorption of far red light reverts the receptor to its Pfr-form. In plants phytochromes control a multitude of morphological processes such as germ formation, flowering and the circadian clock. The phytochrome functions in other organisms are still unclear. In the present work tetrapyrroles have been synthesized carrying 13C and 15N labels. They were employed for vibrational and nuclear magnetic resonance spectroscopy of the Cph1 and PhyA proteins. In addition chromophores with structural modifications have been generated. The tetrapyrroles have been synthesized by a de-novo approach as also via extraction from Spirulina platensis. In this case, the obtained PCB was modified at the ethylidene side chain of the A-ring. Total synthesis followed the classical route by Gossauer starting by synthesizing the pyrrole rings separately, then generating the AB- and CD-half of the molecule and finally condensed both parts to form the Tetrapyrrole molecule. The preparation of the specifically labeled chromophores required an alternative route distinct from that one originally established in the workgroup. For that reason new synthetic routes have been developed - depending on the specific labeling requested and the isotope origin. As far as known (22-15N)-phycocyanobiline was synthesized for the first time starting with 15N glycine. Within two steps this starting material could be converted to the isonitrile and afterwards composed to form the C-ring. The synthesis of (123-13C)-phycocyanobilin was performed by beginning with the reaction of (13C)-sodium cyanide with 3-bromo-propionaldehyde dimethylacetal. The reaction pathway yielded 4-acetoxy-5-nitrohexane methylester in four steps. This product could then be converted furthermore to yield ring C. Furthermore two phycocyanobilins have been synthesized carrying an isotope-labelling in the outer methine bridges (C5 and C15). (2-13C)-2-Bromo acetic acid was used as isotope source for the (5-13C)-phycocyanobiline, and for the synthesis of (15-13C)-phycocyanobline dimethylformamide was used. For the auto-assembly with the protein the esters had to be converted into the di-acid. The chromophore was assembled to Cph1 und PhyA which were then subjected to vibrational spectroscopy. The (15-13C)-phycocyanobiline was incorporated likewise to PhyA and Cph1 which were then studied in collaboration with the groups of P. Hildebrandt and M.A. Mroginski (Berlin). As a result, it was possible to identify the C15 signal of the RR-spectrum. The combination of experimental RR-spectra with simulated spectra which have been achieved via a new QM/MM hybrid methodology allowed the ZZZssa conformation of the chromophore to be confirmed in the protein pocket (unpublished). Such geometry had been formerly proposed by the crystallography studies. In addition, (15-13C)-phycocyanobilin was also assembled to Cph1 and studied by femtosecond stimulated Raman spectroscopy in the groups of C. Lagarias (Davies, USA) and R.A. Mathies (Berkeley, USA). The measurements of the hydrogen out of plane vibrations of the CD Methin-bridge gave crucial evidence for the Z/E isomerization taking place at this position adjacent to the D-ring. These results clearly contradict a recently presentend assumption of a photo-induced isomerization at the A-ring methane-brige. Besides the isotopic labeling of phycocyanobiline (3), the chromophore was also extracted from Spirulina platensis. In addition to the chromophore itself, two by-products have been isolated and characterized. The compounds originate from a nucleophilic attack of the methanol (solvent) at the chromophore ethylidene group (“methanol adducts”). Nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements (still to be performed) would then lead to a precise analysis of the methanol adducts. The isolated phycocyanobilin was also converted into a 31-cysteine adduct for nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Also, isolated PCB was cleaved by thiobarbituric acid following the method of Manitto and Monti, giving a ready access to either (left or right) half of PCB. The cleaving products have been characterized. As biliverdine IXα is serving also as a native phytochrome chromophore, it was synthesized through the oxidation of bilirubin for further studies. After chromophore cleavage and recondensation of both halves, (19-13C)-biliverdin IXα could be prepared. The incorporation of the 13C source enabled the recondensation and yielded the new C10 methin-bridge. This material (10-13C)-biliverdin was assembled to Agp1 and CphB by the group of P. Hildebrandt (Berlin) and analysed by RR-spectroscopy. The isotopic labeling of the C10 methin-bridge resulted in splitting of the usually broad signal for this structural element hence allowing an identification of the signal of the central methin-bridge (unpublished).
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie
Dokument erstellt am:	21.01.2011
Dateien geändert am:	21.01.2011
Promotionsantrag am:	04.11.2010
Datum der Promotion:	09.12.2010