Dokument: Biochemische und genetische Untersuchungen des Transkriptionsregulators Efg1 aus Candida albicans

Titel:	Biochemische und genetische Untersuchungen des Transkriptionsregulators Efg1 aus Candida albicans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16989
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110110-115819-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Biol. Kurtz, Dagmar [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,50 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.01.2011 / geändert 07.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Stichwörter:	Candida albicans, Transkriptionsfaktor Efg1
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	APSES-Proteine sind „basic helix-loop-helix“ (bHLH)-Transkriptionsfaktoren in Ascomyceten, die die Morphogenese zwischen kugelförmigen und filamentösen Zellformen regulieren. Der humanpathogene Pilz Candida albicans enthält mit Efg1 und Efh1 zwei zur Familie der APSES-Proteine gehörende Transkriptionsfaktoren. Die molekularen Mechanismen der Zielgenerkennung und die posttranslationalen Modifikationen von APSESProteinen sind noch weitgehend unklar. Das Efg1-Protein wurde als Fusionsprotein mit einem N-terminalen Dekahistidin- Epitop heterolog in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae und homolog in C. albicans produziert und durch Metallaffinitätschromatographie aufgereinigt. Das aus E. coli isolierte Efg1-Protein wurde erfolgreich zur Herstellung eines polyklonalen Anti-Efg1-Antiserums in Kaninchen eingesetzt. Das Anti-Efg1-Antiserum eignete sich zur Identifikation von Efg1 in C. albicans Rohextrakten und zur Immunpräzipitation von Efg1. Mit Hilfe von deletierten Efg1-Varianten konnte gezeigt werden, dass das Anti-Efg1-Antiserum mit mehreren Efg1-Epitopen interagiert. In Immunoblot-Analysen konnte Efg1, das aus S. cerevisiae und C. albicans isoliert worden war, als Dreifachbande mit molekularen Massen von 75, 83 und 88 kDa detektiert werden. Behandlung mit Lambda-Proteinphosphatase führte zum Abbau der 88 und 83 kDa Proteine zugunsten des 75 kDa Proteins. Da aus E. coli isoliertes Efg1 eine molekulare Masse von 75 kDa aufweist, kann angenommen werden, dass die 83 und 88 kDa Varianten auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind, wobei das 83 kDa-Phosphoprotein die Hauptform von Efg1 darstellt. Analyse des Phosphorylierungszustands von deletierten Efg1 Varianten zeigte, dass lediglich die Deletion der konservierten APSES/bHLH Domäne zu einem Verlust der Phosphorylierung führte. Zudem konnte im zeitlichen Verlauf nach Hypheninduktion eine Änderung des Efg1-Phosphorylierungsmusters im Immunoblot festgestellt werden, wobei die 88 kDa Form ab- und die 83 kDa Form zunahm. Die Efg1-Phosphorylierung erfolgt unerwarteterweise nicht durch Proteinkinase A (PKA), da tpk1 und tpk2 Mutanten ein unverändertes Efg1 Phosphorylierungsmuster zeigten. Das Efg1 Phosphorylierungsmuster veränderte sich ebenfalls nicht bei hypoxischem Wachstum, obwohl Efg1 unter diesen Bedingungen als Repressor und nicht als Aktivator wirkt. Transkriptionsfaktoren des bHLH-Typs bilden typischerweise Homo- oder Heterodimere, die für Efh1, aber nicht für Efg1 durch Zweihybriduntersuchungen bisher nachgewiesen wurden. Durch Gelfiltrationschromatographie wurde die molekulare Masse von gereinigtem Efg1 aus E. coli und aus C. albicans mit ca. 180 kDa bestimmt, die einem Homodi- oder -trimer entspricht. Spontane Homodimerisierung ist vermutlich die Voraussetzung für die DNA-Bindung von gereinigtem Efg1, die durch Verzögerungsgele mit einem EFG1 Promotorfragment nachgewiesen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse bilden die Voraussetzung für weiterführende Arbeiten zur Klärung der Phosphorylierungsstellen von Efg1, der beteiligten Kinasen und der dreidimensionalen Struktur von Efg1. APSES proteins are „basic helix loop helix“ (bHLH)-transcription factors in ascomycetes which regulate morphogenesis between a yeast and a filamentous growth form. The human fungal pathogen Candida albicans contains two transcription factors, Efg1 and Efh1, which are members of the APSES-family. Molecular mechanisms of gene regulation by APSES proteins and their posttranslational modifications are largely unknown. The decahistidine-tagged Efg1 fusion protein was produced in the heterologous hosts Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae and in the homologous host C. albicans and was purified by metal affinity chromatography. E. coli-produced Efg1 protein was used successfully for the production of a polyklonal rabbit anti-Efg1 antiserum. The antiserum was suitable for the detection of Efg1 in C. albicans crude extracts and to immunoprecipitate Efg1. With the help of Efg1 deletion variants it could be shown that the anti-Efg1 antiserum interacts with several epitopes of Efg1. Efg1 isolated from S. cerevisiae and C. albicans could be detected by immunoblotting following SDS-PAGE as a triple band with apparent molecular masses of 75, 83 and 88 kDa. Treatment with lambda phosphatase led to degradation of the 88 and 83 kDa proteins in favour of the 75 kDa protein. Because E. coli-produced Efg1 migrates as a 75 kDa protein it is concluded that the 83 and 88 kDa variants are phosphoproteins and that the 83 kDa phosphoprotein represents the main form of Efg1. Analysis of the phosphorylation status of Efg1 deletion variants showed that only the deletion of the conserved APSES/bHLH domain led to a loss of Efg1 phosphorylation. A time-dependent change of the Efg1 phosphorylation status could be observed after hyphae induction, in which the 88 kDa form decreased and the 83 kDa form increased. Unexpectedly, the phosphorylation of Efg1 appeared not to be caused by protein kinase A, because tpk1 and tpk2 mutants showed unchanged Efg1 phosphorylation patterns. The Efg1 phosphorylation pattern also did not change under hypoxia, although Efg1 functions under these conditions as a repressor and not as an activator. Transcription factors of the bHLH type typically form homo- or heterodimers, which were previously confirmed for Efh1 by two-hybrid analysis but not for Efg1. By gel filtration chromatography the apparent molecular mass of Efg1 purified from E. coli and C. albicans was determined as approximately 180 kDa corresponding to a homodi- or -trimer. Spontaneous homodimerization is probably the precondition for DNA binding of purified Efg1, which was proven by a gel retardation assay using a EFG1 promoter fragment. The obtained results are the prerequisite to identify Efg1 phosphorylation sites, to identify the kinases involved and to establish the three dimensional structure of Efg1.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	10.01.2011
Dateien geändert am:	07.01.2011
Promotionsantrag am:	08.11.2010
Datum der Promotion:	14.12.2010