Dokument: Entwicklung eines Rhodobacter-basierten Systems zur Synthese wirtsfremder Proteine und Phospholipide

Titel:	Entwicklung eines Rhodobacter-basierten Systems zur Synthese wirtsfremder Proteine und Phospholipide
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16770
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101214-145314-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Katzke, Nadine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,15 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.11.2010 / geändert 15.11.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Schurr, Ulrich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Fettsäuren und Phospholipide werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Da eine chemische Synthese dieser Verbindungen nicht effizient möglich ist, werden sie vorwiegend mittels biotechnologischer Verfahren produziert. Besonders in der grünen Biotechnologie werden Fettsäure-modifizierende Enzyme vielfach zur Funktionalisierung von Fettsäuren eingesetzt, jedoch ist die dazu notwendige genetische Modifikation dieser Organismen schwierig. Alternativ können Mikroorganismen als Produzenten von Fettsäuren und Phospholipiden verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit sollte das phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus zum einen zur heterologen Expression von Fettsäure-Desaturasen und zum anderen zur Produktion wirtsfremder Phospholipide eingesetzt werden. Dazu wurden zunächst die Expressionseigenschaften des neuen T7-Expressionsstamms R. capsulatus B10S-T7 anhand der heterologen Expression des Reporterproteins YFP näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung steigender Induktorkonzentrationen die Ausbeute des heterologen Proteins graduell moduliert werden kann. Die maximal erzielten Ausbeuten in diesem Stamm betrugen 30mg L-1 OD-1 unter aeroben und 80mg L-1 OD-1 unter phototrophen Bedingungen. Zusätzlich konnte die Ausbeute von YFP in R. capsulatus B10S durch die Deletion der wirtseigenen Proteasen Lon, ClpP und HslV erhöht werden. Um als Substrat für Fettsäure-modifizierende Enzyme wirtsfremde Fettsäuren in die Membran von R. capsulatus zu integrieren, wurden die Zellen in der Gegenwart von Fettsäuren im Kulturmedium inkubiert. Ölsäure, Linolsäure, cis-Vaccensäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, aber nicht konjugierte Linolsäure, konnten in die Wirtsmembran integriert werden. Die Aufnahmeeffizienz für Ölsäure und Linolsäure konnte durch die Inhibierung der Biosynthese wirtseigener ungesättigter Fettsäuren weiter verbessert werden. Durch die Optimierung wurden Anteile der wirtsfremden Fettsäuren an den Gesamtfettsäuren der Membran von bis zu 37% erzielt. Abschließend konnte durch die heterologe Expression von Fettsäure-Desaturasen gezeigt werden, dass diese Enzyme in E. coli BL21(DE3) akkumulieren. Eine Begrenzung der Expressionszeit auf vier Stunden war essentiell für eine hohe Ausbeute. Aktivitätsanalysen zeigten, dass nur die Desaturasen aus Bacillus subtilis und Stappia aggregata in aktiver Form exprimiert wurden. In R. capsulatus wurden hingegen nur geringe Mengen des heterologen Proteins synthetisiert und keine Aktivität nachgewiesen. Die durchgeführten Arbeiten konnten allerdings mögliche Limitierungen für zukünftige Versuche zur heterologen Expression von Fettsäure-Desaturasen und anderen Enzymen sowie zur weiteren Verbesserung des T7-Expressionssystems in R. capsulatus aufzeigen. Fatty acids and phospholipids are used for a multitude of applications. As chemical synthesis of those compounds is not efficiently possible, they are usually produced via biotechnological processes. Especially in green biotechnology, fatty acid-modifying enzymes are widely used for the functionalization of fatty acids. However, genetic modification of these organisms is time-consuming and complicated. Alternatively, microorganisms can be used as producers of fatty acids and phospholipids. Within this thesis, the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus has been used for heterologous expression of fatty acid desaturases as well as for production of foreign phospholipids. To this end, first the expression properties of the new T7 expression strain R. capsulatus B10S-T7 were characterized by heterologous expression of the reporter protein YFP. It was shown that addition of increasing concentrations of inducer could modulate the yield of the heterologous protein. The maximum yield with this strain was 30mg L-1 OD-1 under aerobic and 80mg L-1 OD-1 under phototrophic growth conditions. Additionally, the yield of YFP in R. capsulatus B10S could be increased by deletion of endogenous genes encoding the proteases Lon, ClpP and HslV. To incorporate foreign fatty acids into the membrane of R. capsulatus as substrates for fatty acid modifying enzymes, the cells were grown in the presence of various fatty acid supplements in the culture medium. Oleic acid, linoleic acid, cis-vaccenic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, but not conjugated linoleic acid, could be integrated into the host membrane. The assimilation efficiency for oleic and linoleic acid could be further increased by specific inhibition of the endogenous biosynthesis of unsaturated fatty acids. This optimization allowed for the foreign fatty acid to be integrated into the membrane to yield up to 37% of total fatty acids. Finally, heterologous expression of fatty acid desaturases showed that these enzymes accumulated in E. coli BL21(DE3). Limiting expression time to four hours proved to be essential to obtain high yields. Activity analysis showed that only the desaturases from Bacillus subtilis and Stappia aggregata were functionally expressed. In R. capsulatus only small amounts of the heterologous proteins were synthesized and no activity was detectable. However, the experiments revealed possible limitations for future studies about heterologous expression of fatty acid desaturases and other enzymes as well as for further improvement of the T7 expression system in R. capsulatus.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	14.12.2010
Dateien geändert am:	15.11.2010
Promotionsantrag am:	16.03.2010
Datum der Promotion:	12.07.2010