Dokument: Charakterisierung der Autotransporter-Protease SprS aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Charakterisierung der Autotransporter-Protease SprS aus Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Characterization of the autotransporter-protease SprS of Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16768
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101115-121047-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr Serci, Stephanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.11.2010 / geändert 15.11.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Pseudomonas aeruginosa, ein Gram-negativer opportunistischer Krankheitserreger, ist Auslöser einer Vielzahl verschiedenster Infektionen und zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen. Die Virulenz des Bakteriums beruht auf der Produktion eines Arsenals zellassoziierter und extrazellulärer Faktoren. Eine große Bedeutung haben hier die Autotransporter-Proteine (AT-Proteine), denen eine Eigenschaft als Virulenzfaktor zugesprochen wird. Diese Proteine bilden mit einer C-terminalen Domäne eine Pore in der äußeren Membran, durch welche die katalytisch aktive Domäne in den extrazellulären Raum transportiert wird. Durch Sequenzanalysen konnte das Gen sprS im Genom von P. aeruginosa identifiziert werden. Ein angefertigtes Homologiemodell des C-Terminus des entsprechenden Proteins zeigt die Zugehörigkeit von SprS zu bereits charakterisierten AT-Proteinen, wie EstA aus P. aeruginosa oder NalP aus N. meningitidis. Aufgrund des Konsensusmotivs GTSMA um das katalytisch aktive Serin 308 kann SprS zur Familie der Subtilisin-ähnlichen Proteasen gezählt werden. Die katalytische Triade besteht neben Serin 308 aus Histidin 122 und Aspartat 79. Eine BLAST-Analyse ergab eine weite Verbreitung von SprS-Homologen in zahlreichen human- und phytopathogenen Pseudomonaden sowie in anderen pathogenen Bakterien-Spezies. In dieser Arbeit wurde SprS, das bislang als putative Serinprotease PA3535 annotiert ist, als möglicher Virulenzfaktor sowohl auf molekularer Ebene als auch hinsichtlich seiner biologischen Funktion charakterisiert. SprS konnte erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert und in einer annähernd reinen Form für Aktivitätstest gewonnen werden. Eine Aktivität gegenüber gängigen Protease-Substraten konnte nicht nachgewiesen werden, wobei unklar bleibt, ob hierfür eine Fehlfaltung des rekombinanten Proteins verantwortlich ist, oder aber, ob von dieser Untergruppe der Subtilisin-ähnlichen Proteasen, zu der auch Ssp-h1 aus S. marcescens zählt, spezifische, bislang unbekannte Substrate gespalten werden. Auch die Expression des proteolytisch aktiven N-Terminus allein führte zu keiner messbaren Aktivität gegenüber herkömmlichen Substraten. Transkriptionsstudien von sprS zeigten, dass das Gen in der spät-logarithmischen Phase des Wachstums exprimiert wird. Interessanterweise konnte zudem nachgewiesen werden, dass die Expression von sprS bei niedrigen Temperaturen verstärkt induziert wird. Es konnte ein deutlicher Einfluss von SprS auf verschiedene, mit der Virulenz in Verbindung stehende Phänotypen von P. aeruginosa beobachtet werden. Der sprS-negative Stamm zeigte eine starke Tendenz zur Zellaggregation und eine damit verbundene, verstärkte Biofilmbildung. Dieser adhäsive Phänotyp weist auf eine veränderte Oberfläche der Zellen von ΔsprS hin, was durch eine Proteomanalyse der äußeren Membran bestätigt werden konnte. Die Analyse extrazellulärer Proteine im sprS-defizienten Stamm zeigte u. a. Veränderungen bezüglich der Proteinmenge und der Aktivität zweier als Virulenzfaktoren beschriebener Proteasen, der Elastase LasB und der Protease IV. In weiterführenden Transkriptionsstudien wurde beobachtet, dass die veränderten Proteinmengen dieser beiden Proteasen im sprS-negativen Stamm bereits auf transkriptioneller Ebene beeinflusst wurden. Anhand von real time-PCR-Analysen ergaben sich deutliche Unterschiede bezüglich der Transkription weiterer ausgewählter Protease-Gene im sprS-negativen Stamm, was auf eine koordinierte Regulation der Proteasen in P. aeruginosa hindeutet. Eine zweite Subtilisin-ähnliche Protease, SprP aus P. aeruginosa, wurde im sprS-negativen Stamm verstärkt exprimiert, was einen funktionellen Zusammenhang der beiden Proteasen nahelegt. Anhand von Reporterfusionen konnte ein direkter Einfluss von sprS auf die Promotoraktivität von sprP beobachtet werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass auch die Promotoraktivität von sprS selbst durch das Wiedereinbringen einer Plasmid-kodierten Kopie des sprS-Gens in den sprS-negativen Stamm auf Wildtyp-Niveau absinkt, was die Präsenz eines Rückkopplungsmechanismus vermuten lässt. Aufgrund der Beobachtung, dass eine Reihe wichtiger Virulenzfaktoren im sprS-negativen Stamm in veränderter Menge produziert werden, wurde in den Modellorganismen Arabidopsis thaliana und Drosophila melanogaster die Pathogenität der beiden Stämme PAO1 und ΔsprS vergleichend überprüft. In beiden Modellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Pathogenität von ΔsprS herabgesetzt ist. SprS, ein weiteres AT-Protein, ist an der Modulation virulenzassozierter Funktionen beteiligt und kann damit als ein bislang unbekannter Virulenzfaktor aus P. aeruginosa angesehen werden. The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is a causative agent of a variety of chronic and acute infections and an important cause of nosocomial pneumonia. The bacterium produces several cell-associated and extracellular virulence factors, including the family of autotransporter proteins (AT proteins). A C-terminal domain of these proteins forms a pore within the outer membrane, through which the catalytically active N-terminus is translocated into the extracellular space. By sequence alignments the gene sprS was identified in the genome of P. aeruginosa. Homology modeling of the C-terminus suggested that SprS belongs to the group of already characterized AT proteins, such as EstA from P. aeruginosa and NalP from Neisseria meningitidis. Moreover, the presence of a GTSMA consensus sequence surrounding the catalytic serine 308 suggests that SprS is a member of the family of subtilisin-like proteases. In addition to serine 308, the catalytic triad of SprS is composed of histidin 122 and aspartate 79. Blast analyses revealed a wide distribution of SprS-homologous proteins in numerous human- and phytopathogenic pseudomonades as well as in other pathogenic bacteria. In the present study SprS, which is annotated as putative serine protease PA3535, was characterized structurally and its physiological function was investigated. SprS was successfully overexpressed in E. coli and was purified for subsequent activity assays. However, proteolytic activity against common substrates, neither of the full length protein nor of the N-terminal catalytic domain alone, could be observed. Whether this lack of activity is caused by misfolding of the recombinant protein, or members of this subgroup of subtilisin-like proteases, including Ssp-h1 of S. marcescens, cleave specific and yet unkown substrates, remains uncertain. Studies on the transcription of sprS revealed that the gene is expressed in the late logarithmic growth phase. Interestingly, expression of sprS was shown to be upregulated at lower temperatures. Phenotypic studies using a sprS-deficient strain indicated that SprS has a significant impact on several virulence-associated phenotypes, such as rhamnolipid production and hemolysis. sprS-negative cells tend to aggregate in culture and form biofilms thicker than the wild type strain, suggesting a modified cell surface of ∆sprS, which was verified by proteomic analyses of the outer membrane. In addition, the sprS-negative strain secreted different amounts of the elastase LasB and the protease IV, two proteases, which were shown to contribute to the pathogenicity of P. aeruginosa. The altered protease concentrations in ∆sprS were already induced on the transcriptional level as shown by detailed transcription studies. Real time-PCR analyses demonstrated that the genes of several proteases are differentially expressed in the sprS-negative strain, suggesting a coordinated regulation of the P. aeruginosa proteases in a network-like manner. Expression of the second subtilisin-like protease SprP of P. aeruginosa was upregulated in ∆sprS, indicating a functional relation of these two proteases. By the use of reporter fusion constructs it was shown that SprS directly influences the promoter activity of sprP. Upon reconstitution of the sprS-negative strain with an episomal copy of the gene, both the expression levels of sprP and sprS itself, which are significantly increased in ∆sprS, dropped to wild type levels, suggesting a feedback regulation of sprS. The aberrant levels of several virulence determinants in ∆sprS lead us to investigate the pathogenicity of the mutant strain in two different model organisms, Arabidopsis thaliana and Drosophila melanogaster, and compare it to the wild type PAO1. In both models a significantly reduced pathogenicity of the ∆sprS strain was observed. SprS, a novel AT protein, modulates several virulence-assocciated functions, and hence may be regarded as a so far unknown virulence factor of P. aeruginosa.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	15.11.2010
Dateien geändert am:	15.11.2010
Promotionsantrag am:	07.06.2010
Datum der Promotion:	12.07.2010