Dokument: Systemische Analyse des Citratzyklus in C. glutamicum

Titel:	Systemische Analyse des Citratzyklus in C. glutamicum
Weiterer Titel:	Systemic analysis of the tricarboxylic acid cycle in C. glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16738
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101118-083320-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	van Ooyen, Jan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,78 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.11.2010 / geändert 11.11.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ansätze der Systembiologie bieten durch die Nutzung genomweiter in silico Analysen in Verbindung mit molekulargenetischen Stammverbesserungen einen vollständigeren Blick auf die L-Lysin Bildung. Ein kürzlich erstelltes genomweites metabolisches Modell von C. glutamicum (Kjeldsen 2009) wurde weiter optimiert und vervollständigt. Sowohl die Analyse dieses Modells, als auch Literaturstudien wiesen die Citratsynthase, CS, als vielversprechendstes Ziel der Verbesserung der L-Lysinausbeute von C. glutamicum aus. Ziel dieser Arbeit war es die Korrelation zwischen Stofffluss über die CS und L-Lysinausbeute experimentell zu untersuchen und globale Konsequenzen zu studieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Gen der CS, gltA, in Form zweier monocistronischer mRNAs transkribiert wird. Die Transkriptionstartpunkte liegen dabei 121 bp und 357 bp strangaufwärts des Startcodons. Durch Northernblotanalysen, Reportergenstudien und EMSA konnte dabei ein komplexes Szenario der Regulation von gltA durch die Regulatoren RamA, RamB und GlxR aufgezeigt werden. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden die beiden Promotoren mitsamt ihrer regulatorischen Regionen gegen Promotoren deutlich reduzierter Stärke aus einer dapA Promotorkollektion ersetzt. Als Ergebnis standen neun Stämme mit graduell reduzierter CS-Aktivität zur Verfügung mit einer Bandbreite von 32 – 6 % der CS-Aktivität des Ausgangsstammes. Die Charakterisierung dieser Stämme zeigte, dass bereits die Reduktion auf 32 % der CS-Aktivität in einer signifikanten Steigerung der Lysinausbeute resultiert. Die Stämme mit deutlich stärker reduzierter CS-Aktivität zeigten noch höhere Lysinausbeuten. Bei 6 % der ursprünglichen CS-Aktivität wurde eine Lysinausbeute von 0.32 g g-1 festgestellt was gegenüber dem Referenzstamm einer 88 %igen Steigerung entspricht. Gleichzeitig wurde eine deutliche Abnahme der Wachstumsrate festgestellt. Diese Korrelation zeigt, dass die CS als ein Schalter zwischen Bildung von Biomasse auf der einen und Lysinbildung auf der anderen Seite genutzt werden kann. Die Reduktion der CS-Aktivität auf 10 % in einem besseren Lysinproduzenten führte zu einem Stamm mit einer Lysinausbeute von 0.5 g g-1, was die höchste aller bislang publizierten Lysinausbeuten darstellt. Die genomweiten Transkriptionsanalysen zeigten, dass unter anderem, vor allem die durch die Regulatoren RamA und RamB regulierten Gene auf die Reduktion der CS-Aktivität reagieren. Die Messung der intrazellulären Metabolitkonzentrationen zeigte eine teilweise Erhöhung der Metabolite der Glycolyse sowie auch von Aminosäuren der Aspartatfamilie, während die Konzentrationen von Citrat, 2 Oxoglutarat und Prolin reduziert waren. Die Bestimmung der extrazellulären Raten im Bioreaktor zeigte, dass die spezifische Glucoseaufnahme- und CO2-Produktionsrate durch die Verringerung der CS-Aktivität nicht signifikant verändert waren, wohingegen die spezifische Lysinbildungsrate nahezu verdoppelt war. Die Raumzeitausbeute konnte dadurch um 35 % gegenüber dem Ausgangsstamm gesteigert werden. Zusammengenommen ergeben die Daten, dass die Beeinflussung der CS ein außerordentlich effektives Instrument ist um die Synthese von L-Lysin, sowie vermutlich auch weiterer Aminosäuren, zu beeinflussen, und das dabei auch noch nicht ganz verstandene systemische Ursachen zum tragen kommen. A more holistic view on L-lysine formation is offered by systems biology approaches making use of genome-scale in silico analyses together with metabolic engineering. A genome-scale metabolic model for C. glutamicum has recently been generated (Kjeldsen 2009) and optimized. Its analyses, as well as literature data, pointed at citrate synthase (CS) as a promising target to further increase L-lysine yields. Aim of this work was to clarify if a correlation between flux over CS and L-lysine yield as seen in flux balance analysises, could be proven experimentally. This work shows that the CS gene gltA of C. glutamicum is encoded by two monocistronic transcripts with their transcript initiation sites located 121 bp and 357 bp upstream of the translational start site. Northern blot analyses revealed that the short transcript prevails during growth on acetate, whereas the long transcript is dominant during growth on glucose. Further Experiments revealed that the transcriptional regulators RamA, RamB and the global regulator GlxR are involved in the regulation of gltA expression in a complex scenario. Based on this knowledge the entire upstream region of gltA was replaced with significantly reduced transcription activity of a dapA-promoter collection. As a result nine mutants were obtained, exhibiting a gradual decrease in the CS specific activity from 32 %, respectively 6 % of the original CS activity. These strains were assayed for their L-lysine formation. Already the reduction of the CS activity to 32 % yielded a significant increase in L-lysine yield from 0.16 to 0.20 g g-1. With a further decrease in the CS activity the yield is further increasing up to 0.32 g g-1 at the lowest CS activity of 6 %. At the same time the growth rate was gradually decreased, showing a correlation between CS activity and L-lysine yield accompanied by a decreased growth rate. Thus, CS can be used as a switch between lysine production on the one hand and biomass formation on the other hand. Using the L-lysine producer DM1933 and lowering its specific CS activity to 10 %, a L-lysine yield of 0.5 g g-1 could be obtained, being the highest yield reported so far. Global gene expression analyses revealed amongst others that with reduced CS activity genes controlled by RamA and RamB were altered in their expression. Furthermore, quantifications of intracellular metabolite concentrations revealed an increase of glycolytic intermediates, as well as aspartate and aspartate-derived amino acids, at reduced CS activity, whereas citrate, 2 oxoglutarate and proline concentrations decreased. Extracellular rates of the strains during batch fermentation were determined in bioreactors, showing that the specific rates of glucose uptake and CO2 production were not affected by reduced CS activity, whereas growth rate was reduced and the L-lysine formation rate nearly doubled. Space time yield obtained were thus up to 35% higher than in the parental strain. Taken together the data show that influencing CS is a very powerful instrument to increase L-lysine, and probably other aspartate derived aminoacids, although systemic consequences are not fully understood.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	17.11.2010
Dateien geändert am:	11.11.2010
Promotionsantrag am:	30.03.2010
Datum der Promotion:	11.05.2010