Dokument: Lokalisierung und Funktion des Lectins B aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Lokalisierung und Funktion des Lectins B aus Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Localisation and function of the lectin B from Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16715
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101111-095838-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bartels, Kai-Malte [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,12 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.11.2010 / geändert 09.11.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	P. aeruginosa ist ein fakultativ pathogenes Bakterium, das in Patienten mit geschwächtem Immunsystem für eine Vielzahl von Infektionen, insbesondere in den Lungen von CF-Patienten, verantwortlich ist. Zusätzlich zur hohen intrinsischen Resistenz gegenüber vielen der gängigen Antibiotika wird die Behandlung von P. aeruginosa-induzierten Infektionen durch die Formation von Biofilmen auf dem betroffenen Gewebe erschwert. Zum pathogenen Potential des Bakteriums tragen diverse Virulenzfaktoren bei. Darunter befinden sich die beiden Lectine LecA und LecB, die eine natürliche Affinität zu D-Galactose bzw. D-Mannose und L-Fucose aufweisen und eine Rolle bei der Biofilmbildung von P. aeruginosa spielen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zur Funktion und Lokalisierung des Lectins LecB. Nach der Expression des lecA- und des lecB-Gens im heterologen Wirt E. coli erfolgte die affinitätschromatographische Reinigung der Lectine unter Ausnutzung der intrinsischen Affinität zu D-Galactose bzw. D-Mannose. Die gereinigten Lectine wurden erfolgreich für die Analyse der inhibierenden Wirkung von LecA- und LecB-spezifischen Glycopeptid-Dendrimeren eingesetzt. Der Sekretionsmechanismus der zu einer extracytoplasmatischen Lokalisierung von LecB führt, ist derzeit unbekannt. Durch Zellfraktionierung und anschließendem immunologischen Nachweis wurden zwei LecB-Varianten im Periplasma von P. aeruginosa detektiert. Dieses Vorhandensein periplasmatischer Intermediate beweist, dass die Sekretion des Lectins durch einen Zweischritt-Sekretionsmechanismus erfolgen muss. Ferner wurde erstmalig gezeigt, dass im Periplasma zwei voneinander verschiedene LecB-Oligomere vorliegen, wobei eines das apparente Molekulargewicht eines Dimers und das andere das apparente Molekulargewicht eines Trimers aufweist. Das Dimer wird aus 12,6 kDa großen Monomeren und das Trimer aus 13,8 kDa großen Monomeren ausgebildet. Mittels entsprechender Nachweismethoden wurde gezeigt, dass das 12,6 kDa große Monomer wahrscheinlich Fucose- oder Mannosereste und das 13,8 große Monomer am Asparaginrest 22 eine N-Glycosylierung trägt. Durch den immunologischen Nachweis in subzellulären Fraktionen mit einer LecB-Variante, in der die N-Glycosylierungsstelle Asn22 gegen ein Alanin ausgetauscht wurde, konnte nachgewiesen werden, dass die Integrität dieser (N-Glycosylierungs-) stelle Voraussetzung für eine LecB-Sekretion über die Cytoplasmamembran ist. Es ist bekannt, dass die Aminosäure Asn22 in der Zuckerbindestelle des Lectins vorliegt. Dies wirft die Frage auf, ob eine veränderte Zuckerbindeaffinität oder die N-Glycosylierung des Lectins direkt die molekulare Erklärung für die Unterschiede bei der Translokation des Proteins über die innere Membran ist. Außerdem wurde in dieser Arbeit das äußere Membranprotein OprF als Zelloberflächenrezeptor des Lectins LecB und als erstes N-glycosyliertes Protein in P. aeruginosa überhaupt identifiziert. Dieser Befund bietet einen Einstieg in weiterführende Studien zum Verhalten von P. aeruginosa während früher Phasen von Infektionen, in denen Adhäsionsphänomene an Gewebe von entscheidender Bedeutung sind. Sollte eine Modulation von Bindeeigenschaften zu einer Veränderung der Infektiosität führen, würden Strategien zur Veränderung der LecB- OprF-Interaktionen Wege zur Entwicklung neuartiger Therapeutika eröffnen können. Ferner könnte ein detaillierteres Verständnis dieser neuen Oberflächenstrukturen Grundlage für die Entwicklung neuer und wirksamer Vakzine gegen P. aeruginosa sein. P. aeruginosa, a facultative pathogenic bacterium, is responsible for a number of infections in immunocompromised patients, especially for cases of pneumonia in patients suffering from cystic fibrosis. In addition to the extensive intrinsic resistance against antibiotics, the treatment of P. aeruginosa-induced infections is complicated by the formation of biofilms in the affected tissue. Different factors of virulence, including the lectins A and B, which have a high natural affinity to D-galactose, D-mannose and L-fucose and play an important role in the formation of biofilms of P. aeruginosa, contribute to the pathogenicity of these bacteria. The purpose of this study was the examination of the function and localization of lectin B. The intrinsic affinity to D-galactose and D-mannose, was used to purify the lectins by chromatography after gene expression in E. coli. The purified lectins were used to analyse the inhibitory effects of LecA- and LecB-specific glycopeptide dendrimers. The mechanism of secretion leading to an extra-cytoplasmatic localization of LecB is still unknown. Two different variants of LecB were identified in the periplasm of P. aeruginosa by cell fractionation and immunological analysis. The presence of periplasmatic intermediates proves that LecB secretion is a two-step mechanism. Moreover, two different periplasmic oligomers of LecB were identified for the first time, one with the molecular weight of a dimer, the other of a trimer. The dimer is composed of 12.6 kDa monomers and the trimer of 13.8 kDa monomers. It is shown that the 12.6 kDa monomer is fucosylated or mannosylated and that the 13.8 kDa monomer carries an N-linked-glycosylation at residue Asn22. Immunological analysis of the cellular location of a LecB-variant which carried mutation Asn22Ala revealed that the integrity of this N-linked-glycosylation is critical for the secretion of LecB to the cell surface. It is known that amino acid Asn22 is located at the LecB glycosylation-site, a fact that raises the question whether the differences in translocation of the protein over the inner membrane can be explained by a modified affinity of glycosylation or by the N-linked-glycosylation of the lectin itself. Moreover, this study describes for the first time the outer membrane protein OprF as a surface receptor of LecB and as an N-linked-glycosylated protein in P. aeruginosa. These findings may guide the way to further studies regarding early phases of infection by P. aeruginosa, in which adhesion to tissues is critical. If the modulation of P. aeruginosa binding to host tissues results in reduced infectivity, strategies to alter the LecB-OprF-interactions could lead to the development of new therapeutical agents. Morover, a precise understanding of these surface structures could allow for the development of new anti P. aeruginosa vaccines.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	11.11.2010
Dateien geändert am:	09.11.2010
Datum der Promotion:	25.01.0010