Dokument: Interaktion von c-Src mit der viralen Polymerase NS5B des Hepatitis C Virus und Generierung NS5B-spezifischer humaner Antikörperfragmente
| Titel: | Interaktion von c-Src mit der viralen Polymerase NS5B des Hepatitis C Virus und Generierung NS5B-spezifischer humaner Antikörperfragmente | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16534 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101025-112524-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Büther, Katrin [Autor] | |||||||
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| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das Hepatitis C Virus stellt weltweit eine der Hauptursachen chronischer Lebererkrankungen dar und ist damit ein globales gesundheitspolitisches Problem. Die gegenwärtige Therapie
basiert auf einer Kombination von pegyliertem Interferon-α und Ribavirin, geht jedoch Genotyp-abhängig einher mit niedrigen Ansprechraten, bei vergleichsweise hoher Frequenz an zum Teil schwergradigen Nebenwirkungen. Die Entwicklung von alternativen und effektiveren Strategien zur Behandlung einer HCV-Infektion ist daher von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang ist die genaue Kenntnis der zellulären Faktoren, die die virale Replikation determinieren, von essentiellem Interesse, um neben viralen auch zelluläre Angriffspunkte einer therapeutischen Intervention zu identifizieren. In einem ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss zellulärer Hydratationsänderungen auf die virale Replikation analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass eine hypoosmotisch bedingte Zunahme der zellulären Hydratation über bislang unverstandene Mechanismen die virale Replikation im subgenomischen Replikon-Modell unterdrückt, während diese durch hyperosmolare Inkubationsbedingungen unbeeinflusst blieb. In einem zweiten Teil der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die zelluläre Tyrosinkinase c-Src essentiell für die Replikation von HCV ist, und dass c-Src mit der viralen Polymerase NS5B zumindest über seine SH3-Domäne interagiert. Inhibitorstudien und der Einsatz c-Src-spezifischer siRNA legen nahe, dass c-Src die subzelluläre Lokalisation von NS5A und NS5B bestimmt und das Hemmung von c-Src möglicherweise zu einer Störung der Replikonstruktur führt. Im dritten Teil der Arbeit erfolgte mit Hilfe eines Phagen-Display aus einer aus HCV-infiziertenPatienten hergestellten Phagenbibliothek die Isolation affiner Einzelkettenantikörperfragmente gegen essentielle Motive der viralen Polymerase NS5B sowie gegen Volllängen-NS5B. Die Bindungsaktivität der bakteriell exprimierten scFv wurde mittels ELISA überprüft, und nach Verdau und Immunoblot-Analysen erfolgte die Analyse und Charakterisierung der Sequenzen der positiven scFv hinsichtlich ihrer Integrität. Darüber hinaus gelang es bei den gegen Volllängen-NS5B generierten scFv in einem Polymerase-Aktivitäts-Assay zu belegen, dass sie in vitro die Aktivität einer rekombinant generierten NS5B-Polymerase hemmen.The hepatitis C virus represents one of the major causes of chronic liver disease worldwide and is, therefore, a global health policy problem. Current therapy is based on the combination of pegylated interferon-α and ribavirin, but it is genotype-dependent accompanied by a low response rate with comparatively high frequency of severe side-effects. The development of alternative and more effective strategies for the treatment of HCV infection is of great importance. In this regard, the precise knowledge of the cellular factors that determine viral replication is of essential interest to identify both viral and cellular targets of therapeutic intervention. In the first part of the thesis, the influence of alterations of cellular hydration on viral replication was analysed. It could be shown that viral replication in the subgenomic replicon model was inhibited by hypoosmotic increase of cellular hydration via so far unknown mechanisms, whereas it was unaffected by hyperosmotic incubation. In the second part of the thesis it could be demonstrated that the cellular tyrosine kinase c-Src is crucial for the replication of HCV and that c-Src interacts with the viral polymerase NS5B at least via its SH3 domain. Inhibitor studies and the use of c-Src specific siRNA suggest that c-Src regulates the subcellular localisation of NS5A and NS5B and that inhibition of c-Src potentially leads to a disruption of the replicon structure. In the third part of the thesis a phage display from a phage library cloned from patients infected with HCV was carried out for the isolation of high affinity single-chain antibody fragments against essential motifs of the viral polymerase NS5B and full length NS5B. Binding activity of bacterially expressed scFv was assessed via ELISA and after digestion and immunoblot analysis the sequences of positive scFv were analysed regarding their integrity. Furthermore, it was possible to show, using a polymerase activity assay, that the scFv generated against full length NS5B inhibit the activity of a recombinant NS5B polymerase in vitro. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.10.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.10.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.10.2009 | |||||||
| Datum der Promotion: | 12.01.2010 |
