Dokument: Molekulare Analyse des pleiotropen ABC-Transporters Pdr5 aus S. cerevisiae

Titel:	Molekulare Analyse des pleiotropen ABC-Transporters Pdr5 aus S. cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16524
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101025-100952-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Küppers, Petra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 22,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.10.2010 / geändert 20.10.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Der ATP-binding cassette (ABC)-Transporter Pdr5 ist der Hauptvertreter der pleiotropen Drogenresistenz (PDR) der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Er gehört zu einer besonders vielfältigen Familie von Membrantransportproteinen, die durch die Hydrolyse von ATP den Transport einer Vielzahl strukturell und funktionell unterschiedlicher Substanzen über die Membranen vermitteln. ABC-Transporter sind ubiquitär und kommen in allen Bereichen des Lebens vor. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die hohen Expressionslevel von Pdr5 in einem genetisch modifizierten PDR1-3 Expressionsstamm genutzt, um eine allgemein anwendbare Klonierungs-kassette zur Expression und Reinigung unterschiedlicher Membranproteine über einen Affinitätstag zu etablieren. Die Evaluation erfolgte dabei durch eine standardisierte Aufreinigung unterschiedlicher Transportsysteme der Hefe, die den Einsatz der entwickelten Strategie als High-Throughput Methode bestätigen konnte. Im zweiten Teil wurde der PDR ABC-Transporter Pdr5 als Modellsystem detailliert untersucht. Die Bedeutung dieser Transportsysteme in klinisch relevanten Erkrankungen ist eindeutig definiert, allerdings ist das molekulare Verständnis bezüglich der exakten Mechanismen in der Bereitstellung der Energie und der engen Verknüpfung von Substraterkennung und –translokation bislang noch sehr limitiert. In diesem zentralen Teil der Arbeit wurde der Exporter durch gezielte Mutationen funktionell in vivo und in angereicherten Plasmamembran Präparationen auf seine ATPase- und Transportaktivität untersucht. Eine katalytische Dyade aus einem Histidin und einem Glutamat als funktionelle Einheit des ATP-Hydrolyse Mechanismus konnte dabei für Pdr5 eindeutig ausgeschlossen werden, obwohl dieses Wirkprinzip bislang mit den meisten analysierten ABC-Transportern in Einklang gebracht werden konnte. Lediglich das Glutamat ist für die Pdr5 spezifische Aktivität essentiell, während das Histidin keinen Einfluss auf die basale ATPase Aktivität ausübt. Stattdessen beeinflusste die Mutation des konservierten Histidins (H1068A) selektiv den Substratransport, die eine Entkopplung der ATPase Aktivität in Pdr5 vom Transport bestimmter Substrate wie Rhodamin 6G belegte. Des Weiteren wurde die PDR spezifische Degeneration der ansonsten konservierten Konsensussequenzen analysiert, die eine funktionelle Asymmetrie der NBDs mit einer katalytisch aktiven (C-Terminus) und einer regulatorischen ATP-Bindungstasche (N-Terminus) bestätigte. Die Rekonstruktion der degenerierten Motive zur Generierung symmetrischer NBDs führte zum vollständigen Verlust der Aktivität, während die Mutation einzelner Motive teilweise gar keinen Effekt bewirkten. Einen Einblick in die Mechanismen der Substratselektvität der pleiotropen ABC-Transporter wurde durch die gezielte Analyse der proteinspezifischen Interaktionen mit Substraten, Modulatoren und Energiequellen ermöglicht. Dabei wurde nicht nur die tatsächliche Funktion des Modulators FK506 als Substrat von Pdr5 identifiziert, sondern auch die spezifische sensorische Funktion eines konservierten Serins in der putativen Substratbindetasche. Die Substratselektivität wird dabei ebenfalls durch die NBDs definiert, sei es durch eine Mutation wie z.B. beim H-loop (H1068A) oder durch die Wahl der Energiequelle, die jeweils zu einer Verschiebung des Substratspektrums führen können. Der Einfluss wird dabei vermutlich durch eine Kombination von physikalisch, thermodynamischen und kinetischen Faktoren bestimmt, die in einem vereinfachten Kinetik Model zusammengefasst werden können. Letztlich scheint die nicht-stimulierbare, hohe ATPase Aktivität der PDR ABC-Transporter in Kombination mit der konservierten Degeneration in den NBDs die Funktionalität und Selektivität dieser besonderen Familie von MDR-Transportern zu definieren, was sich auch in dem differentiellen Hydrolysemechanismus widerspiegelt. The major player of the Pleiotropic Drug Resistance (PDR) in baker´s yeast Saccharomyces cerevisiae is the ATP-binding cassette (ABC)-transporter Pdr5. ABC-transporters such as Pdr5 are ubiquitous membrane transport proteins utilizing the energy derived by ATP hydrolysis to translocate a multiplicity of structural and functional diverse substances across biological membranes. In the first part of this thesis, the high expression levels of Pdr5 in the genetically modified PDR1-3 transcription background were exploited to establish a versatile cloning cassette for expression and purification of any membrane protein by affinity chromatography. Different yeast transport systems were genetically modified and purified by a simple standard protocol establishing this strategy as a convenient High Throughput method. The detailed analysis of the PDR ABC-transporter Pdr5 as a model system is described in the second part of the thesis. The crucial role of ABC-transporters in clinical relevant diseases is clearly defined, however, knowledge about the exact mechanistic features in energy allocation and its tight coupling to substrate recognition and translocation is still limited. To address these questions, the exporter Pdr5 was investigated intensively by directed mutagenesis in combination with functional assays in vivo and in highly enriched plasma membrane preparations by ATPase and Rhodamine 6G transport measurements. Contrary to the general acceptance of a catalytic dyad consisting of a conserved histidine and glutamate as the functional unit in ATP-hydrolysis, the existence of such a functional linchpin in Pdr5 can be excluded. In contrast to the histidine, which had no impact on the basal ATPase activity, the derived data clearly assigned the necessity of the conserved glutamate adjacent to the Walker B motif for functional activity. The H-loop mutation (H1068A) rather affected selectively the transport of Rhodamine 6G, thus supporting an uncoupling of the Pdr5 specific ATP-hydrolysis from the transport of certain substances. Additionally, the functional analysis of the PDR specific degeneration of the consensus sequences revealed a functional asymmetry of the NBDs with a catalytic C-terminal and a regulatory N-terminal ATP-binding pocket. The reconstruction of the degeneration for a symmetric NBD motor domain abrogated Pdr5 specific ATPase and transport activity completely, whereas single reconstructed motives had no effect. Further insights into the mechanisms of the substrate selection processes in pleiotropic ABC-transporters were achieved by a systematic analysis of the protein specific interactions with substrates, modulators and energy resources. By this approach, for the first time the definite role of the modulator FK506 as a substrate of Pdr5 was affirmed. Moreover, the specific sensory function of a conserved serine located in the putative substrate binding pocket could be delineated in the concrete mode of communication between the functional domains of Pdr5. Furthermore, structure-function relations clearly assigned an important role of the NBDs in substrate selectivity as well. Mutations within the conserved sequences such as the H-loop mutant as well as the application of different nucleotides led to a dramatic shift in substrate selectivity. Summarized in a simplistic kinetic substrate selection model, the selectivity is regulated by thermodynamic and kinetic parameters in the protein specific interactions. Finally, the characteristic, non-stimulateable steady state ATPase activity combined with the highly conserved degeneration of the NBDs in the PDR ABC-transporters seem to define the functionality and selection process in this special kind of MDR transport systems, which can be mirrored in the differential mechanism of ATP hydrolysis.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	25.10.2010
Dateien geändert am:	21.10.2010
Promotionsantrag am:	02.09.2010
Datum der Promotion:	29.09.2010