Dokument: Etablierung der Tandem Affinity Purification (TAP)-Methode am Beispiel des Cardialen Ankyrin Repeat Proteins (CARP) in Säugetierzellen
| Titel: | Etablierung der Tandem Affinity Purification (TAP)-Methode am Beispiel des Cardialen Ankyrin Repeat Proteins (CARP) in Säugetierzellen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16461 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101013-114641-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kwak, Min-Seok [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gödecke, Axel [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Soboll, Sybille [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | CARP, TAP-Tag, Ankyrin Repeats, Hypertrophie | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibung: | Ziel dieser Arbeit war es die Bedeutung des Cardialen-Ankyrin-Repeat-Proteins im Rahmen der Pathophysiologie verschiedener Kardiomyopathien darzustellen, und die Tandem-Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinkomplexen aus Säugetierzellen zu etablieren. Quantitative Real-time-PCR-Messungen ergaben eine erhöhte Expression von CARP in Herzen mit gesteigerter Nachlast durch transversale Aortenkonstriktion sowie bei einer NO-induzierten dilatativen Kardiomyopathie. Interessanterweise führte Induktion einer kardialen Hypertrophie mittels Isoproterenol-Belastung zu keiner gesteigerten CARP Expression, so dass nicht die Hypertrophie per se ein Signal für die gesteigerte CARP Expression sein kann.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein effizientes Protokoll für die Tandemaffinitätsreinigung von CARP aus Säugerzellen etabliert. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde die CARP cDNA kloniert und als getaggtes Protein in HEK293T-Zellen exprimiert. Immunhistochemische Untersuchung des Fusionsproteins zeigte eine authentische subzelluläre Lokalisation. Es konnte zudem gezeigt werden, dass CARP nicht nur strikt im Zellkern vorkommt, sondern auch im Zytoplasma lokalisiert ist. Durch schrittweise Optimierung des TAP-Tags und der Elutionsbedingungen von verschiedenen Affinitätsmatrices gelang es schließlich, CARP aus Säugtierzellen reproduzierbar in einem Zweischrittverfahren über 1. Immunaffinitätschromatographie (anti-Flag Tag Antikörper) und 2 . eine Strep II-Tag-Streptactin Affinitätssäule zu isolieren. Dabei wurde eine Vielzahl spezifisch koeluierender Proteine nachgewiesen, die als Bindungspartner von CARP nach ihrer Identifizierung Auffschluss über die bisher unbekannte Funktion von CARP geben könnten. Speziell die Massenspektrometrie stellt eine hocheffiziente Technologie dar, um in der Zukunft Interaktionspartner von CARP zu identifizieren. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.10.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.10.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.05.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.09.2010 |
