Dokument: Entwicklung neuartiger Wirt - Vektor Systeme mit breitem Wirtsspektrum zum funktionsbasierten Screening von Metagenombanken

Titel:	Entwicklung neuartiger Wirt - Vektor Systeme mit breitem Wirtsspektrum zum funktionsbasierten Screening von Metagenombanken
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15971
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101012-103701-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Tröschel, Sonja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,89 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.01.2011 / geändert 31.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Metagenom, Shuttle-Vektoren, funktionsbasiertes Screening, Biokatalysatoren, heterologe Expression, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Hintergrund: Das Metagenom, die Gesamtheit aller genomischen Information der Organismen eines Habitats, wird als unerschöpfliche Quelle für bioaktive Moleküle ange-sehen. Da nur ein Bruchteil dieser Organismen kultivierbar ist (< 1%) kann die Information nicht genutzt werden. Daher können kulturunabhängige Verfahren, in denen die metagenomische DNA isoliert, kloniert und durchmustert wird, angewendet werden. Aktivitätsbasierte Screenings sog. Metagenombanken hängen von der funktionalen Genexpression und Proteinsynthese im heterologen Organismus ab. Die Verwendung unterschiedlicher heterologer Wirte eröffnet dabei zusätzliches Expressionspotential und führt zur Detektion einer größeren Anzahl und Vielfalt von bioaktiven Molekülen. Zielsetzung: Ein Modulsystem aus neuartigen Shuttle-Vektoren und verschiedenen bereits etablierten bakteriellen Wirten sollte entwickelt werden, um heterologe Genexpression und Proteinsynthese parallel in verschiedenen Organismen untersuchen zu können. Ergebnisse: Erstmalig konnte in dieser Arbeit eine Serie von Shuttle-Vektoren, die in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonas putida strukturell stabil vorlagen, entwickelt werden. Diese wurden gemäß ihrem Wirtsspektrum pEBP genannt. Die Verwendung des Vektors pEBP18 als Expressionsplasmid wurde in den oben genannten Wirten durch Analysen der Expression von zwei lipolytischen Enzymen und von GFP validiert. Für Metagenom-Analysen wurden Proben aus verschiedenen Bodenabflüssen in einem Schlachthof entnommen. Kultivierbare Organismen wurden angereichert, morphologisch beschrieben und über ribosomale DNA-Analysen klassifiziert. Weiterhin wurde metagenomische DNA in den Vektor pEBP18 kloniert. Die erzeugten Genbanken wurden funktionsbasiert durchmustert. In E. coli (5 x 105 Klone) wurden Klone mit lipolytischer, proteolytischer und hämolytischer Aktivität, sowie ein Pigment-produzierender Klon detektiert. Weiterhin kam es bei 0,25% aller Kolonien zur Expression des Transkriptionsreporters GFP durch die Erkennung von Promotoren, die durch die metagenomische Insert-DNA kodiert wurden. In P. putida (8 x 104 Klone) wurden viele Klone mit Esterase-/Lipase- und einige mit Protease-Aktivität gefunden. Ausgewählte Plasmide der Genbanken wurden in alle drei Wirte übertragen. Es konnten unterschiedliche Aktivitäten der Klone festgestellt werden. Fazit: Die neuartigen Shuttle-Vektoren sind universell als Cosmide, Expressionsplasmide und genetic trap Vektoren einsetzbar. Weiterhin können sie als Genbankvektoren in E. coli, B. subtilis und P. putida genutzt werden. Dies eröffnet die Möglichkeit viele neuartige, bioaktive Molekülen des Metagenoms zu identifizieren. Background: The metagenome, the genetic information of all organisms in a given habitat, is an untapped resource for bioactive molecules. Considering that only a small part of microorganisms is cultivable (< 1%) most of the biological information is not accessible. Therefore, culture-independent methods comprising isolation of DNA as well as the construction and screening of clone libraries have been established. Activity-based analysis of metagenomic libraries rely on functional gene expression and protein synthesis in the heterologous host. Thus, additional expression capability will be gained, if the range of bacterial hosts is expanded leading to the detection of a larger amount and variety of bioactive molecules. Aim: Construction of a modular system of novel shuttle-vectors for the use in different well established bacterial host organisms developed for simultaneous study of heterologous gene expression and protein production. Results: For the first time, a set of shuttle-vectors was developed which were stable in Escherichia coli, Bacillus subtilis and Pseudomonas putida and were named pEBP due to their host spectra. The utilisation of the vector pEBP18 as expression plasmid was confirmed by studying expression of two lipolytic enzymes and GFP functioning as transcriptional reporter. For metagenomic analysis, samples were collected from bottom drains in a butchery. Cultivable organisms were enriched, described by morphology, and classified by ribosomal DNA analysis. Metagenomic DNA was cloned into the vector pEBP18. The resulting libraries were screened for enzymatic activities. In E. coli libraries (5 x 105 clones) lipolytic, proteolytic, and hemolytic activity, and one pigment producing clone were detected. In addition, 0.25% of all clones showed GFP expression which was caused by metagenomic DNA encoded promoters, maybe useful for other expression studies. Various clones with lipolytic and just a few clones with proteolytic activity were detected in P. putida (8 x 104 clones). Furthermore, a subset of plasmids was shuttled into all three hosts where varying activities were observed. Conclusion: The novel shuttle-vectors can be applied as cosmids, expression plasmids, and genetic trap vectors. In addition, these vectors can be utilized to screen libraries in E. coli, B. subtilis and P. putida. Thus , a novel and unique method was developed to mine metagenomes for bioactive molecules.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	12.10.2010
Dateien geändert am:	31.01.2011
Promotionsantrag am:	21.04.2010
Datum der Promotion:	15.06.2010