Dokument: Dom34 als regulatorischer Faktor der O-Glykosylierung in Candida albicans
| Titel: | Dom34 als regulatorischer Faktor der O-Glykosylierung in Candida albicans | |||||||
| Weiterer Titel: | Dom34 as a regulatory factor of O-glycosylation in Candida albicans | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15681 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100720-152159-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Hilbig, Jessica Saskia [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | O-Glykosylierung, Candida albicans, Dom34, Translation, no-go decay, Pmt | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Protein-O-Mannosylierung des humanpathogenen Pilzes Candida albicans ist für sein Wachstum, sowie für seine Zellmorphologie und Pathogenität essentiell. Das Dom34-Protein ist Mitglied der in Archaea und Eukaryonten hoch konservierten Dom34/Pelota-Proteinfamilie, das für die Translation, den „no go“-RNA-Abbau und möglicherweise auch für die O-Glykosylierung von Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde die potentielle Funktion des Dom34-Proteins für die O-Mannosylierung von C. albicans, die durch 5 Isoformen von Protein-O-Mannosyltransferasen (Pmt) eingeleitet wird, untersucht.
Während homozygote dom34-Mutanten von C. albicans keinerlei Defektphänotypen zeigten, wurde mit dom34 pmt1-Doppelmutanten, denen die Pmt-Isoform 1 und das Dom34-Protein fehlt, eine genetische Interaktion der DOM34- und PMT1-Gene nachgewiesen. Doppelmutanten zeigten eine erhöhte Sensitivität gegenüber Hygromycin B und gegenüber Wachstum bei erhöhten Temperaturen. Darüber hinaus wurde durch DOM34-Überexpression die Hygromycin B- und Temperatursensitivität einer pmt1-Mutante supprimiert. DOM34-Überexpression supprimierte ebenfalls die defekte Hyphenbildung und die verringerte O-Glykosylierung des Pmt1-Zielproteins Kre9. Die Suppression der pmt1-Phänotypen benötigt offenbar die Aktivität der Pmt-Isoformen 5 und 6, da in pmt1 pmt5- und pmt1 pmt6-Doppelmutanten keine Suppression zu beobachten war. Dom34/Pelota-Proteine zeigen Homologie zu Translations-Faktoren der eRF1-Familie. DOM34-Überexpression führte in einem Wildtypstamm mit Epitop-markiertem Pmt1-Protein zu einer deutlichen Erhöhung der Pmt1-Produktion, obwohl durch qRT-PCR keine Steigerung des PMT1-Transkriptspiegels und der übrigen PMT-Transkripte gezeigt werden konnte. Zur weiteren Untersuchung des Einflusses von Dom34 auf die Translation des Pmt1-Proteins wurde überprüft, ob eine Fusion des PMT1-Promotors mit dem Reportergen RLUC durch DOM34-Überexpression reguliert wird. Hierbei wurde eine Stimulierung der RLUC-Expression durch Dom34 nachgewiesen, die von Sequenzen innerhalb des 5´-untranslatierten Bereiches des PMT1-Transkripts abhängig ist. Ähnliche Sequenzen sind auch in der 5’-UTR des PMT5-Transkripts vorhanden, so dass eine regulatorische Funktion von Dom34 bei der Translation der Pmt1- und Pmt5-Proteine wahrscheinlich ist. Ein konservierter Glutaminsäurerest innerhalb der Dom34/Pelota-Proteine ist für eine in vitro-RNase-Funktion des Pelota-Proteins aus Thermoplasma acidophilum essentiell. Eine RNase-Aktivität des C. albicans Dom34-Proteins, das in Escherichia coli synthetisiert wurde, konnte jedoch nicht bestätigt werden. Andererseits führte eine E21A-Mutation zu einem Verlust der Dom34-Fähigkeit, die Phänotypen einer pmt1-Mutante zu supprimieren. Es kann somit angenommen werden, dass E21 des Dom34-Proteins im Zusammenhang mit einer spezifischen Funktion, z. B. der RNA-Bindung, bei der Translation der Pmt-Proteine steht.Protein-O-Mannosylation is essential for growth, morphology and virulence of the human fungal pathogen Candida albicans. Dom34 is a member of the highly conserved Dom34/Pelota protein-family in archaea and in eukaryotes and is involved in translation, “no go”-RNA-degradation and possibly O-glycosylation. In this thesis the possible function of Dom34 in O-mannosylation, which is initiated by 5 isoforms of protein-O-mannosyltransferases (Pmt), was investigated. While no defective phenotype of a homozygous dom34-mutant was observed in C. albicans, a genetic interaction of DOM34 and PMT1 was detected by analysis of a dom34 pmt1 double mutant strain lacking the Pmt1 isoform and the Dom34 protein. Double mutants showed an increased sensitivity against hygromycin B and growth at higher temperatures. Furthermore, hygromycin B- and temperature-sensitivity of the pmt1-mutant was suppressed by DOM34-overexpression. Also, DOM34-overexpression suppressed defective hypha-formation and reduced O-glycosylation of the Pmt1-target protein Kre9. It appears that activity of Pmt isoforms 5 and 6 are needed for suppression of the pmt1 phenotype, since suppression did not occur in pmt1 pmt5- and pmt1 pmt6-double mutant strains. Dom34/Pelota-proteins share homology to translation factors of the eRF1-family. In a wild-type strain with epitope-labeled Pmt1-protein DOM34 overexpression lead to a significant increase of Pmt1-production, although no increase of the transcript levels for PMT1 and the other PMT genes could be observed by qRT-PCR analyses. To further explore the influence of Dom34 on Pmt1-protein translation we tested if a PMT1-promotor fusion to the reportergene RLUC is regulated by DOM34 overexpression. In these experiments a stimulation of RLUC-expression by Dom34 was discovered, which depended on sequences within the 5’-untranslated region of the PMT1-transcript. Similar sequences were also found in the 5’-UTR of the PMT5-transcript, which suggests a regulatory function of Dom34 in translation of the Pmt1- and Pmt5-proteins. A conserved glutamic acid residue within the Dom34/Pelota-protein is essential for the in vitro-RNase function of Pelota in Thermoplasma acidophilum. However, RNase-activity of C. albicans Dom34 synthesized in Escherichia coli could not be confirmed. On the other hand, a E21A mutation lead to the loss of Dom34 ability to suppress the pmt1 mutant phenotypes. Therefore, it can be assumed that E21 of the Dom34 protein is required for a specific function of Dom34, e. g. RNA-binding, during translation of Pmt-proteins. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.07.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 19.07.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.05.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.06.2010 |
