Dokument: Autodisplay der humanen Proteinkinase CK2 und Entwicklung eines Verfahrens zur Inhibitionstestung
| Titel: | Autodisplay der humanen Proteinkinase CK2 und Entwicklung eines Verfahrens zur Inhibitionstestung | |||||||
| Weiterer Titel: | Autodisplay of human protein kinase CK2 and development of an inhibition assay | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15669 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100720-094704-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Gratz, Andreas [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | CK2, Proteinkinase, Inhibition, Inhibitor, Autodisplay, Krebs, Wirkstoff, Kapillarelektrophorese | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die humane Proteinkinase CK2 ist ein heterotetrameres Enzym, welches aus zwei α- und zwei β-Untereinheiten besteht. In dieser Arbeit wurde jede der beiden Untereinheiten als Autodisplay-Passagier an der Zelloberfläche von Escherichia coli präsentiert. Durch Coexpression der beiden Autotransporter-Fusionsgene in einem E. coli-Stamm konnte erstmalig das Autodisplay eines heterotetrameren Enzyms gezeigt werden. Sowohl Stämme, welche nur die α-Untereinheit präsentierten, als auch Stämme, welche beide CK2-Untereinheiten an der Oberfläche trugen, zeigten in radiometrischen Tests CK2-Aktivität. Mit diesen Zellen als Quelle des Zielmoleküls CK2 konnte so der IC50 Werte des bekannten CK2-Inhibitors TBB bestimmt werden. In dem beide Untereinheiten tragenden E. coli BL21(DE3)-Stamm ergab sich für TBB ein IC50 Wert von 0,295 µM, der gut mit Literaturwerten übereinstimmte. Bei der Suche nach neuen Wirkstoffen ist neben der Verfügbarkeit des Zielmoleküls ein verlässliches und aussagekräftiges Testsystem von entscheidender Bedeutung. Zur Entwicklung eines neuen nicht-radiometrischen Testsystems für CK2 wurde dessen Substratpeptid RRRDDDSDDD C-terminal mit EDANS und N-terminal mit DABCYL konjugiert. Durch die räumliche Nähe entsteht ein FRET-Effekt, bei dem der Quencher DABCYL die Fluoreszenz von EDANS unterdrückt. In einer gekoppelten Enzymreaktion wurde dieses Peptid zunächst durch CK2 am Serylrest phosphoryliert, wodurch die Erkennungssequenz der anschließend eingesetzten pankreatischen Elastase maskiert wurde. Das Ausmaß der Phosphorylierung dieser Erkennungssequenz durch CK2 war der entscheidende Faktor für die Effizienz des darauffolgenden proteolytischen Entwicklungsschritts mit Elastase. Das nicht-phosphorylierte Peptid wurde mit höherer Effizienz durch Elastase hydrolysiert, was den Verlust des FRET-Effekts zur Folge hatte. Der daraus resultierende Anstieg der Fluoreszenzintensität bei 535 nm konnte nach Anregung bei 355 nm quantifiziert werden und war umgekehrt proportional zur Aktivität der CK2. Neben der qualitativen Erfassung der CK2-Aktivität ermöglichte dieser Test grundsätzlich die Identifizierung von Inhibitoren. Aufgrund einer geringen Sensitivität war mit diesem FRET-basierten Verfahren aber keine verlässliche Bestimmung von IC50 Werten durchführbar. Um diese verwirklichen zu können, wurde ein zweites Testverfahren entwickelt. Es basiert auf einer durch die Phosphorylierung induzierten Veränderung der elektrophoretischen Mobilität eines Substratpeptids der CK2. Dieses Peptid wurde sowohl in fluorophorkonjugierter Form RRRDDDSDDD-[EDANS], als auch in unkonjugierter Form RRRDDDSDDD als CK2-Substrat eingesetzt. Die Trennung und Quantifizierung von Substrat und Produkt wurde durch Etablierung einer kapillarelektrophoretischen Methode unter Benutzung einer „bare fused silica“ Kapillare und einer absorptionsspektroskopischen Detektion bei 214 nm möglich. Dieses neue Testverfahren eignete sich ausgezeichnet zur quantitativen Bewertung von Inhibitoren der CK2. Die damit bestimmten IC50 Werte der Inhibitoren TBB (0,27 µM) und Emodin (1,33 µM) stimmten gut mit Angaben aus der Literatur überein. Dieser kapillarelektrophoretische Inhibitionstest wurde bei einer Durchmusterung einer Substanzbibliothek eingesetzt und führte zur Identifizierung neuer potenter CK2-Inhibitoren. Die beste Testsubstanz (TF) zeigte einen exzellenten IC50 Wert von 0,03 µM.Human Protein kinase CK2 is a heterotetrameric enzyme composed of two α- and two β-subunits. In this study, each of the two individual subunits was displayed on the cell surface of Escherichia coli using Autodisplay. For the first time, the coexpression of two different autotransporter fusion genes in one strain of E. coli enabled the Autodisplay of a heterotetrameric enzyme. CK2 activity could not only be detected by a radiometric assay for strains that exclusively displayed the α-subunit but also for strains that displayed both subunits of CK2. These cells were employed as a source for the target CK2 in order to determine the IC50 value of the known CK2 inhibitor TBB. The use of host strain E. coli BL21(DE3) that displayed both subunits yielded an IC50 value of 0.295 µM, which is in good agreement with published data. The screening for active agents requires the availability of the target and a reliable and distinct assay method. In order to develop a novel non-radiometric assay for CK2, the N-terminus of the substrate peptide RRRDDDSDDD was labeled with EDANS and its C-terminus with DABCYL. Their proximity causes a FRET effect; the quencher DABCYL suppresses the fluorescence characteristics of EDANS. The assay makes use of a coupled enzyme reaction. At first, serine residue of the substrate peptide is phoshorylated by CK2 which blocks a recognition sequence of the second enzyme, pancreatic elastase. The extent of this CK2-driven serine phosphorylation was crucial for the efficiency of the following proteolytic cleavage step by elastase that produced the readout-signal. The non-phosphorylated peptide was cleaved by elastase with higher efficiency compared to the non-phosphorylated peptide and resulted in a loss of the FRET effect. The resulting increase of fluorescence at 535 nm after excitation at 355 nm could be quantified and was inversely correlated with CK2 activity. It could be demonstrated that this assay not only enables the quantitative detection of CK2 activity, but also allows the identification of inhibitors. However, the poor selectivity prevented the reliable determination of IC50 values. In order to enable quantitative evaluation of inhibitors, a second assay was developed. It is based on the change of electrophoretic mobility that is induced by CK2-catalyzed phosphorylation of a substrate peptide, which was deployed in either a fluorophore-coupled form RRRDDDSDDD-[EDANS] or in an unmodified form RRRDDDSDDD. The separation and quantification of substrate and product was enabled by capillary electrophoresis using a bare fused silica capillary and UV detection at 214 nm. The novel assay is suitable to determine the potency CK2 inhibitors. It could be used to determine IC50 values of the known CK2-inthibitors TBB (0.27 µM) and Emodin (1.33 µM). These values were in excellent agreement with published data. The screening of a compound library by this capillary electrophoresis assay revealed novel CK2 inhibitors. The most potent compound (TF) exhibited an excellent IC50 value of 0.03 µM. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.07.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.07.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.05.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.07.2010 |
