Dokument: Die Rolle der ekto-5'-Nukleotidase (CD73) und des Adenosin A2A Rezeptors bei der Immunmodulation

Titel:	Die Rolle der ekto-5'-Nukleotidase (CD73) und des Adenosin A2A Rezeptors bei der Immunmodulation
Weiterer Titel:	Role of ecto-5´-nucleotidase (CD73) and adenosine A2A receptors on T-cell mediated immune response.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15583
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100713-083258-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Romio, Michael [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,39 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.07.2010 / geändert 10.07.2010
Beitragende:	Prof. Dr. med. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	CD73 Adenosin Th-Zellen Treg-Zellen NFkappaB Zytokine
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Adenosin ist ein wichtiger Mediator bei der Hemmung inflammatorischer Prozesse. Extrazelluläres Adenosin wird bei Immunzellen über die ekto-5’-Nukleotidase (CD73) gebildet. Bei T Zellen wird das von der CD73 gebildete Adenosin von regulatorischen T (Treg) Zellen bereitgestellt und die Freisetzung von IL-2 und IFN-γ wird bei T-Effektor (Teff = Th1 + Th2) Zellen über den A2A Adenosin Rezeptor (A2AR) gehemmt. Generell zeigt der A2AR auf Leukozyten immuninhibitorische Wirkung und die CD73 wird in inflammatorischen Arealen überexprimiert. Vor diesem Hintergrund untersuchte die vorliegende Arbeit die folgenden zwei Fragen: 1. Hemmt Adenosin, das physiologische von der CD73 auf Treg Zellen gebildet wird, die Immunantwort der Teff Zellen? Welchen Einfluss hat der A2AR auf die Zytokinfreisetzung von Treg und Teff Zellen? 2. Kann ein phosphorylierter A2AR Agonist als prodrug dienen, welches durch eine CD73-abhängige Dephosphorylierung den wirksamen A2AR Agonisten (drug) ortspezifisch in inflammatorischen Arealen freisetzt? Im ersten Teil der Arbeit zeigten Untersuchungen an murinen CD4+ aus CD73-/- Mäusen, dass diese nach antigener Stimulation mittels anti-CD3/CD28 eine verstärkte nukleare Translokation des Transkriptionsfaktors NF-κB aufweisen. Parallel zeigten die CD73 defizienten CD4+ T Zellen eine gesteigerte Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-2 und IFN-γ. Die Behandlung von CD4+ T Zellen mit Adenosin [25µM] bewirkte eine A2AR-vermittelte Hemmung der IFN-γ Freisetzung. Auch hemmten AMP [50µM] wirkungsvoll die Freisetzung von IL-2 und IFN-γ aus WT T Zellen. ATP das in den Überständen von WT T Zellen zu finden war, wurde rasch abgebaut. In Proliferationsassays, bei denen Treg Zellen und Teff Zellen kokultiviert wurden, zeigten sich jedoch keine Unterschiede zwischen WT und CD73-/- T Zellen. Eine pharmakologische Aktivierung des A2AR bei Teff Zellen hemmte die Freisetzung von Th1 und Th2 Zytokine, wobei eine stärkere Hemmung bei den Th1 Zytokinen zu finden war. Im Gegensatz dazu beeinflusste eine Aktivierung des A2AR die Zytokinfreisetzung von Treg Zellen nicht. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte die antiinflammatorische und vasodilatorische Aktivität des neu synthetisierten phosphorylierten A2AR Agonisten Cyclohexylethylthio (chet)-AMP (prodrug) und des entsprechenden A2AR Agonisten chet-Adenosin (drug). In in-vitro Experimenten mit T Zellen erwies sich das drug mit nMolarer Affinität zum A2AR (Ki=372nM) als sehr wirksam bei der Hemmung der IFN-γ Freisetzung. Auch das prodrug, das mit einer Dephosphorylierungsrate von 96% ein ähnlich gutes Substrat wie AMP für die CD73 darstellt, hemmte in-vitro die IFN-γ Freisetzung. Da die Wirksamkeit des prodrug von der Aktivität der CD73 abhängt, die durch die Zahl der CD73 exprimierenden Treg Zellen bestimmt ist, war hier die Wirksamkeit des prodrug aber erwartungsgemäß geringer als die des drug. Am isoliert perfundierten Herzen der Maus zeigte das chet-AMP, im Sinne des prodrug Konzeptes, geringere vasodilatorische Aktivität an den Koronararterien. Diese vergleichsweise zu dem drug geringere vasodilatorische Aktivität konnte anschließend in in-vivo Experimenten anhand arterieller Blutdruckmessungen während Infusion von drug und prodrug bestätigt werden. In einem in-vivo Inflammationsmodell, der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA), zeigten drug und prodrug eine starke antiinflammatorische Wirkung. Sowohl chet-Adenosin als auch chet-AMP bewirkten eine 50% Hemmung der CIA. Parallel waren proinflammtorische Zytokine im Serum erniedrigt bzw. das antiinflammatorische IL-10 erhöht. Der in-vivo hohe antiinflammatorische Wirkungsgrad des prodrugs erklärt sich durch die verstärkte Expression der CD73 im entzündlich veränderten Gewebe. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit, dass das von der CD73 gebildete Adenosin und der A2AR eine wichtige modulatorische Rolle im Immunsystem spielt. Insbesondere bei CD4+ T Zellen ist der Nukleotid-Substratfluss über die ekto-Nukleotidase-Kaskade, ein bedeutendes Stellglied im Immunsystem. ATP fungiert hierbei als Kostimulator mit gleichzeitig apoptotischer Wirkung, während Adenosin Immunzellen über den A2AR hemmt und letztlich Anergie bei Leukozyten auslösen kann. Dem von der CD73 gebildet Adenosin kommt hierbei im Wechselspiel mit dem A2AR eine wesentliche antiinflammatorische Rolle zu. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit auch das klinische Potential von phosphorylierten A2AR Agonisten als prodrug bei der Therapie von inflammtorischen Prozessen. Das CIA Modell liefert erste in-vivo Belege, dass das prodrug Konzept als eine ortspezifische antiinflammatorische Therapie im murinen Arthritis Modell tragfähig ist. Adenosine is a potent inhibitor of inflammation. Extracellular adenosine is formed on lymphocytes by the ecto-5’-nucleotidase (CD73). On T cells extracellular adenosine is provided by regulatory T cell (Tregs) and the release of proinflammatory cytokines as IL-2 and IFN-γ by effector T cells (Teff = Th1 +Th2) is inhibited by signaling of the A2A adenosine receptor (A2AR). In general, the A2AR on leukocytes shows immunsuppressive effects. Also CD73 appears to be very important in the immune system, since expression of CD73 is increased in inflammatory areas. Therefore this study investigated the following questions: 1. Does adenosine, physiologically formed by CD73 on Tregs, inhibit the immune responses of Teff cells? What is the role of A2AR signaling on cytokine release of Tregs and Teff cells? 2. Can phosphorylated A2AR agonists serve as prodrug which after dephosphorylation by CD73 acts as A2A agonist (drug)? In the first part of this study with murine CD4+ T cells evidence is provided, that T cells from CD73-/- mice have increased levels of nuclear translocated transcriptionfactor NF-κB after antigenic stimulation with anti-CD3/anti-CD28 antibodies. This was paralleled by increased release of the proinflammatory cytokines IL-2 and IFN-γ. Treatment of T cells with adenosine [25µM] inhibited IFN-γ release via A2AR. Also AMP [50µM] strongly inhibited the release of IFN-γ and IL-2 of WT T cells. ATP found in supernatants of WT T cells was rapidly degraded. Adenosine formed by CD73 on Tregs did not effect in a proliferation assay the suppression of Tregs on Teff cells from both WT and CD73-/- T cells. Pharmacologic activation of A2AR on Teff cells strongly inhibited the release of several Th1 and Th2 cytokines. In contrast, activation of A2AR did not influence cytokine release of Tregs. The second part of this study investigated antiinflammatory and vasodilatory activities of the newly synthesized phosphorylated A2AR agonist cyclohexylethylthio (chet)-AMP (prodrug) and its respective A2AR agonist chet-adenosine (drug). In in-vitro experiments with T cells the chet-adenosine, which has nM affinity to the A2AR (Ki = 347nM), was very effective in inhibiting IFN-γ release. Also chet-AMP, which is as efficiently dephosphorylated (96%) by CD73 as AMP, inhibited IFN-γ release from T cells. Since the potency of the prodrug depends on CD73 activity, the number of CD73 expressing Tregs is critical. In support of the prodrug concept, chet-AMP infused to hearts showed only minor vasodilatory activity. This finding was confirmed in in-vivo experiments by measuring arterial blood pressure during infusion of drug and prodrug. In the in-vivo model of collagen-induced arthritis (CIA) application of drug and prodrug by osmotic minipumps showed strong anti-inflammatory action. Chet-Adenosin as well as chet-AMP inhibited CIA by about 50%. This effect was paralled by decreased serum levels of proinflammatory cytokine IFN-γ and increased serum level of anti-inflammatory cytokine IL-10. In summary this study shows, that adenosine formed by CD73 and acting on A2AR is an important endogenous regulator in the immune system. Very likely nucleotide substrate flux through the ecto-nucleotide cascade on CD4+ T cells is an important control element in the immune system. ATP acts as costimulatory factor with concomitant apoptotic activity through P2X7 receptor, whereas adenosine inhibits immune cells through A2AR activation and finally can elicit leukocyte anergy. Thus, CD73-derived adenosine acting through A2AR plays an important antiinflammatory role. In addition this study also shows the clinical potential of phosphorylated A2AR agonists as prodrugs to treat tissue inflammation. The arthritis model provides first in-vivo evidence to establish the prodrug concept as a novel site specific antiinflammatory therapy.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.07.2010
Dateien geändert am:	10.07.2010
Promotionsantrag am:	01.04.2010
Datum der Promotion:	07.05.2010