Dokument: Interaktionsanalyse der Adapterproteine SLy1 und SLy2
| Titel: | Interaktionsanalyse der Adapterproteine SLy1 und SLy2 | |||||||
| Weiterer Titel: | Interaction Analysis of the Adaptor Proteins SLy1 and SLy2 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15560 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100709-093928-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Brandt, Simone [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die putativen Adapterproteine der SLy (SH3 Protein expressed in Lymphocytes) Familie sind durch das Vorhandensein einer SH3- und einer SAM-Domäne sowie einer zweigeteilten nu-kleären Lokalisationssequenz (NLS) charakterisiert. Für ein tieferes Verständnis der moleku-laren Funktion von SLy1 und SLy2 wurden in der vorliegenden Arbeit das Interaktionsverhal-ten sowie die subzelluläre Lokalisation von SLy1 und SLy2 analysiert.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass beide Proteine sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern lokalisieren. Sie sind zudem in der Membran- und der Mitochondrienfraktion detektierbar. Weder die Deletion der SH3- und der SAM-Domäne noch die Deletion des zweiten Teils der NLS verändert die subzelluläre Lokalisation beider Moleküle wesentlich. Lediglich das SLy1-Protein, bei dem ein Teil der NLS und die phosphorylierbare Aminosäure Serin27 deletiert sind, weist eine ausschließlich zytoplasmatische Lokalisation auf. Im Zuge der Interaktionsanalyse von SLy1 und SLy2 konnte eine über die SH3-Domäne vermittelte Homodimerisierung sowie eine Assoziation von SLy1 und SLy2 mit negativ gela-denen Lipiden identifiziert werden. Die Lipid-Interaktion von SLy1 und SLy2 findet mit Hilfe einer polybasischen Region in und um die NLS beider Moleküle statt. Bei den mit SLy1 und SLy2 interagierenden Lipiden handelt es sich um Membran- und nukleäre Lipide. Im weiteren Verlauf konnte eine phosphorylierungsabhängige Bindung beider SLy-Moleküle an 14-3-3 Proteine dargestellt und insbesondere für SLy2 ein regulativer Mechanismus dieser Interaktion bezüglich der subzellulären Lokalisation aufgezeigt werden. Die Assoziation von SLy2 mit 14-3-3 Proteinen bewirkt eine Retention des Moleküls im Zytoplasma. Für SLy1 wurde die Phosphorylierung am Serin27 als hauptverantwortliche Phosphorylierungsstelle in Bezug auf die Interaktion mit 14-3-3 Proteinen identifiziert. Die bei SLy2 dazu analoge, po-tenzielle Phosphorylierungsstelle am Serin23 spielt bei der Assoziation mit 14-3-3 Proteinen hingegen eine eher untergeordnete Rolle. Für die Suche nach weiteren Interaktionspartnern von SLy1 und SLy2 wurde das Hefe Zwei-Hybrid-System angewendet, mit dessen Hilfe für SLy1 keine Interaktionspartner gefunden werden konnten. Für SLy2 konnte als Interaktionspartner das Molekül SAP30 identifiziert wer-den, welches eine Komponente des nukleären Sin3-HDAC1-Komplexes ist. Schließlich konnten neben der Bindung von SLy2 an SAP30 auch die Interaktion von SLy2 mit der Histondeacetylase HDAC1 und die Generierung eines ternären Komplexes bestehend aus SAP30, HDAC1 und SLy2 mittels Ko-Immunpräzipitation gezeigt werden. Funktionell bewirkt die Assoziation von SLy2 mit HDAC1 eine Steigerung der enzymatischen Aktivität von HDAC1. Der beobachtete Befund stellt eine wichtige Grundlage für eine weitere funktionelle Charakterisierung von SLy2 dar und könnte eine Erklärung der Funktion von SLy2 bei der malignen Transformation von Zellen liefern.The putative adaptor proteins of the SLy (SH3 Protein expressed in Lymphocytes) family are characterized by the existence of a SH3- and a SAM domain as well as a bipartite nuclear localization sequence (NLS). For a deeper understanding of the molecular function of SLy1 and SLy2 the interaction be-haviour as well as the subcellular localization of SLy1 and SLy2 were analyzed in the present work. First of all it could be shown that the two proteins localize both in the cytoplasm and in the nucleus. They are furthermore detectable in the membrane and in the mitochondria fraction. Neither the deletion of the SH3 and of the SAM domain nor the deletion of the second part of the NLS considerably changes the subcellular localization of both molecules. Only the SLy1 protein which lacks a part of the NLS and the phosphorable amino acid serine27 shows an exclusive cytoplasmic localization. In the course of the interaction analysis of SLy1 and SLy2 a homodimerization mediated via the SH3 domain as well as an association of SLy1 and SLy2 with negatively charged lipids could be identified. The lipid interaction of SLy1 and SLy2 occurs via a polybasic region in and around the NLS of both molecules. The lipids that interact with SLy1 and SLy2 are membrane as well as nuclear lipids. In the further course a phosphorylation-dependent association of both SLy molecules with 14-3-3 proteins and in particular for SLy2 a regulative mechanism of this interaction concer-ning the subcellular localization of SLy2 were shown. The association of SLy2 with 14-3-3 proteins causes retention of the molecule in the cytoplasm. For SLy1 the phosphorylation at serine27 was identified to be the main responsible phosphorylation site with respect to the interaction with 14-3-3 proteins. On the other hand the analogous potential SLy2 phosphorylation site at serine23 only plays a subordinate role with regard to the association with 14-3-3 proteins. For the search of further interaction partners of SLy1 and SLy2 the yeast two hybrid system was applied that did not result in finding interaction partners for SLy1. For SLy2 the molecule SAP30 could be identified as an interaction partner which is a component of the nuclear Sin3-HDAC1 complex. Finally next to the association of SLy2 with SAP30 also the interaction of SLy2 with the histone deacetylase HDAC1 and the generation of a ternary complex com-posed of SAP30, HDAC1 and SLy2 were shown by means of co-immunoprecipitation. Func-tionally the association of SLy2 with HDAC1 causes an increase of the enzymatic activity of HDAC1. The observed findings represent an important basis for a further functional charac-terization of SLy2 and might provide an explanation for the function of SLy2 with respect to the malignant transformation of cells. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.07.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.07.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.04.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.06.2010 |
