Dokument: Analyse des Antisigmafaktors Rsd aus E. coli: Charakterisierung von Bindungspartnern, Einfluss von Rsd auf die Transkription und Regulation des rsd-Gens

Titel:	Analyse des Antisigmafaktors Rsd aus E. coli: Charakterisierung von Bindungspartnern, Einfluss von Rsd auf die Transkription und Regulation des rsd-Gens
Weiterer Titel:	Studies on the E. coli anti-sigma factor Rsd: Characterization of binding partners, influence of Rsd on transcriptional activity and regulation of the rsd-gene
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15524
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100708-094720-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hofmann, Nina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 28,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.07.2010 / geändert 05.07.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Stichwörter:	Genregulation, Sigmafaktor, Antisigmafaktor, RNA-Polymerase, Transkription, Escherichia coli, stationäre Phase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das kleine Protein Rsd ist ein Antisigmafaktor für σ70, den Hauptsigmafaktor in E. coli. Beim Übergang in die stationäre Phase bindet Rsd an σ70 und verhindert so die Bildung des Eσ70 Holoenzyms. Dadurch verbessert sich die Möglichkeit der Bindung des alternativen Sigmafaktors σ38 an das Coreenzym der RNAP und für eine Initiation der Transkription σ38-abhängiger Gene. Mittels Retardierungsanalysen und in vitro Transkriptionen wurde die Sigmafaktorspezifität von Rsd in vitro untersucht. Dabei zeigte sich, dass bei den Bindungsstudien Rsd beide Holoenzyme inhibieren kann. Erst bei in vitro Transkriptionen zeigte sich eine selektive Inhibierung des Eσ70 Holoenzyms, während die Aktivität des Eσ38 Holoenzyms nicht beeinträchtigt wurde. Bei einer in vitro Transkription unter Sigmakompetitionsbedingungen um die Bindung an das Coreenzym, konnte erstmalig die Inhibierung der σ70-abhängigen Transkription bei gleichzeitiger Aktivierung der σ38-abhängigen Transkription direkt gezeigt werden. Mittels affinity-binding Experimenten konnte eine Bindung von Rsd an σ38 nachgewiesen werden. Allerdings ergaben sich keine Hinweise auf die Bildung eines stabilen Rsd-RNAP-Komplexes. Mit Hilfe von Primer-Extension Analysen wurde der Einfluss von Rsd auf einige σ70 und σ38-abhängige Promotoren in vivo untersucht. Dabei konnte beobachtet werden, dass Rsd die Transkription von σ38-abhängigen Promotoren in der stationären Phase aktiviert. Eine Inhibierung von σ70-abhängigen Promotoren wurde jedoch nicht gefunden. Den zweiten Teil dieser Arbeit bildete die Analyse der rsd-Expression. Die Transkription des rsd-Gens wird durch zwei Promotoren gesteuert, den σ38-abhängigen P1 Promotor, der in der stationären Phase aktiv ist und den σ70-abhängigen P2 Promotor der konstitutiv über die Wachstumsphasen exprimiert wird. Mittels Bindungsstudien wurde in vitro der Einfluss der Nucleoid-assoziierten Proteine H-NS, StpA, LPR und FIS untersucht. Dabei wurden Bindestellen der Proteine H-NS und StpA im Bereich des P2 Promotors und für FIS am P1 Promotor gefunden. Zusätzlich konnten Bindestellen von LRP und StpA im rsd-Gen nachgewiesen werden. Bei in vivo Analysen zeigte sich allerdings eine Derepression der rsd-Promotoren nur für die Proteine H NS und FIS. Dafür wurden Hinweise darauf gefunden, dass die rsd-Expression abhängig von der Methylierung der DNA ist. Weiterhin ergaben sich Hinweise auf eine Autoregulation von Rsd. Zwar scheint Rsd nicht stringent reguliert zu werden, dennoch gibt es deutliche in vivo und in vitro Effekt von DksA auf die rsd-Expression. The small Escherichia coli protein Rsd is an anti-sigma factor for the primary sigma factor σ70. When cells enter stationary phase Rsd inhibits the formation of Eσ70 holoenzyme by sequestering σ70. As a consequence the alternative σ-factor σ38 directs RNAP to σ38-dependent promoters. By gel-shift and transcription assays, the σ-factor specificity of Rsd was examined. While gel-shift experiments revealed an unspecific inhibition of both holoenzymes, a specific inhibition of the Eσ70 but not of the Eσ38 holoenzyme could be shown by in vitro transcription assays. Furthermore in a σ-factor competition assay σ38 could effectively compete σ70 for core binding, when Rsd was present. Using affinity-binding experiments a direct interaction of Rsd and σ38 could be shown, but the formation of a stable Rsd-RNAP complex was not observed. The in vivo affect of Rsd on σ70- and σ38-dependent promoters was investigated with primer extension analysis. These experiments support the hypothesis of an Rsd-mediated increase in σ38-dependent transcription. In contrast, rsd-mediated decrease of selected σ70-dependent transcripts was not found. In the second part of this work the expression of the rsd-gene was analyzed. Transcription of the rsd-gene is controlled from the σ38-dependent P1 and the σ70-dependent P2 promoter. The P1 promoter is active in stationary phase, whereas the P2 promoter is constitutively expressed. The influence of the nucleoid-associated proteins H-NS, StpA, LRP and FIS was examined in vitro and in vivo. With gel-shift experiments it was possible to identify binding sites for H-NS and StpA at the P2 promoter, whereas FIS-binding sites were found at the P1 promoter site. Additional binding of LRP and StpA was observed in the rsd-gene. The in vivo experiments showed a de-repression of the rsd-promoters only by H-NS and FIS. The results of in vitro and in vivo experiments indicate, that DNA-methylation modulates the rsd-expression. Additional results from in vivo studies support a model in which the rsd-expression is auto-regulated. Most likely the rsd-expression is not under stringent control. Interestingly, DksA causes strong effects on transcription of the rsd-gene, although the effects were invers when results from in vivo and in vitro studies were compared.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Molekularbiologie der Prokaryoten
Dokument erstellt am:	08.07.2010
Dateien geändert am:	05.07.2010
Promotionsantrag am:	11.05.2010
Datum der Promotion:	25.06.2010