Dokument: Wirkung von Flavonoiden auf den redoxsensitiven Nrf2 Signalweg in Säugerzellen

Titel:Wirkung von Flavonoiden auf den redoxsensitiven Nrf2 Signalweg in Säugerzellen
Weiterer Titel:Effects of flavonoids on redoxsensitive Nrf2-signalling in mammalian cells
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20100706-090308-4
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Rohrig, Ricarda [Autor]
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Dateien vom 02.07.2010 / geändert 02.07.2010
Beitragende:Prof. Dr. Wätjen, Wim [Betreuer/Doktorvater]
Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter]
Stichwörter:Nrf2, ARE, Flavonoide, Antioxidantien, HO-1
Dokumententyp (erweitert):Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Auf Grund der in epidemiologischen Studien postulierten gesundheitsförderlichen
Eigenschaften sind Flavonoide auch in konzentrierter Form als Nahrungsergänzungsmittel erhältlich. Als Nahrungsergänzungsmittel bedürfen sie jedoch keiner Zulassung mit entsprechenden toxikologischen Prüfungen, sondern lediglich einer Anmeldung. Für eine toxikologische Bewertung von Flavonoiden ist die Identifizierung ihrer zellulären und molekularen Wirkmechanismen essentiell.
In dieser Arbeit wurden 9 strukturverwandte Flavonoide untersucht. Da der Darm ein erstes Zielorgan der Flavonoide darstellt, wurde die Toxizität der verwendeten
Flavonoide vergleichend in Hct 116 und Caco2 Kolon-Karzinomzelllinien bis zu einer
Konzentration von 100 μM untersucht. In Hct 116 Zellen konnte für 90 μM Galangin, 25 μM Apigenin und 25 μM Chrysin nach 24h Inkubation ein EC50 Wert abgeleitet werden. In Caco2 Zellen konnte lediglich für 50 μM Galangin nach 24h Inkubation ein EC50 Wert bestimmt werden. Somit zeigen die untersuchten Flavonoide eine geringe Zytotoxizität gegenüber den eingesetzten Darmzelllinien. Zur Ermittlung der antioxidativen Kapazität wurden die Flavonoide sowohl zellfrei (TEAC) als auch im Zellkultursystem (DCF) untersucht. Im TEAC-Assay zeigten die Flavonoide bis auf Galangin, Apigenin und ein relativ hohes Reduktionspotential. Im zellbasierten DCF-Assay bestätigten sich im Wesentlichen die Ergebnisse des TEAC-Assays. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden molekulare Wirkungen der verwendeten Substanzen auf den redox-sensitiven Nrf2-Signalweg untersucht. Der
Transkriptionsfaktor Nrf2 reguliert über die Bindung an eine Konsensus-Sequenz, das antioxidant responsive element (ARE), die Expression antioxidativer und fremdstoffmetabolisierender Enzyme und vermittelt so einen Schutz gegenüber zellulärem Stress. Als bekannter Aktivator des Nrf2-Signalwegs führte sowohl die Inkubation mit tBHQ als auch die Inkubation mit Quercetin und Fisetin zu einer Translokation und nukleären Akkumulation von Nrf2. Mit tBHQ konnte bereits mit einer Konzentration von 50 μM und nach 30 min eine deutliche Anreicherung von Nrf2 im Kern gezeigt werden. Quercetin zeigte nach 4h eine nukleäre Lokalisation von Nrf2 in einer Konzentration von 25 μM. Fisetin bewirkte in niedrigeren Konzentrationen (5 μM) nach 4h eine Kern-Akkumulation und auch die Inkubation mit 50 μM Kaempferol führte nach 4h zu einer 5-fachen Nrf2- Kernakkumulation. Die nukleäre Nrf2-Akkumulation durch Quercetin, Kaempferol und Fisetin konnte mikroskopisch durch den Einsatz eines Nrf2-GFP-Fusionsprotein-Konstrukts bestätigt werden. Mit Hilfe eines ARE-Luziferase-Reportergen-Konstrukts wurde überprüft, ob die nukleäre Akkumulation von Nrf2 mit einer Aktivierung des ARE
einhergeht. Die Inkubation von Hct 116 Zellen mit 50 μM tBHQ führte zu einer 7-fachen Zunahme der ARE-abhängigen Luziferase Aktivität. 50 μM Quercetin bewirkten eine zu tBHQ vergleichbare Aktivitätszunahme, für 50 μM Fisetin konnte eine 3,4-fache Induktion und für 50 μM Kaempferol eine 5-fache Induktion der ARE-abhängigen Luziferase Aktivität gemessen werden. In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde die Expression des Nrf2-abhängigen Gens Hämoxygenase 1 (HO-1) untersucht. tBHQ bewirkte eine 4–fache Induktion des
HO-1 Transkripts, wohingegen Quercetin die HO-1 nur leicht induzierte und die anderen Flavonoide die HO-1 Expression nicht induzieren konnten. Dies deutet darauf hin, dass die nukleäre Akkumulation von Nrf2 nach Flavonoidinkubation ausreichend ist für die signifikante Transaktivierung am ARE-Element, jedoch sind vermutlich an der Regulation der HO-1 Expression weitere regulatorische Proteine beteiligt. Nach einem der aktuell diskutierten Modelle der Nrf2 Regulation wird an seinen Inhibitor (Keap1) gebundenes zytosolisches Nrf2 ständig über das Proteasom degradiert und muss konstitutiv neu synthetisiert werden. Dieses Modell wird durch die Ergebnisse gestützt. Zum Einen erfolgt die nukleäre Nrf2-Akkumulation nach Inkubation mit tBHQ innerhalb weniger Minuten, zum Anderen wurde die Nrf2 Expression des Transkriptionsfaktors auf mRNA Ebene nicht durch tBHQ verändert. Ein weiterer Hinweis, welcher für dieses Modell spricht, ist die Tatsache, dass Nrf2 nur nach vorheriger Hemmung der proteosomalen Degradation mit MG132 in der zytosolischen Proteinfraktion detektiert werden konnte. Obwohl einige der untersuchten Flavonoide zu einer nukleären Akkumulation von Nrf2 führten, wirken sie nicht über Hemmung der
Chymotrypsinaktivität des Proteasoms. Zusammengefasst zeigen die vorgestellten
Ergebnisse, dass Flavonoide in der Lage sind, den redox-sensitiven Nrf2-Signalweg zu beeinflussen und somit die zelluläre Stressantwort zu verändern, was für eine abschließende toxikologische Beurteilung dieser Substanzen von Bedeutung ist.

Because of their beneficial effects on health shown by several epidemiologic studies
flavonoids are offered as high-dosed dietary supplements. These dietary supplements do not need any approval or authorization. To be distributed supplements require only a registration. For toxicological risk assessment the estimation of their cellular and molecular effects is essential. Here we characterized the antioxidative capacity of nine structurally related flavonoids. Because colon cells are one of the first sites of contact for the flavonoids the toxicity of the tested flavonoids was assessed in a concentration up to 100 μM, in two colon carcinoma cell-lines, Hct 116 and Caco 2. Hct 116 revealed EC50 values for 90 μM galangin, 25 μM apigenin and 25 μM chrysin after 24h incubation. In Caco 2 cells only for 50 μM galangin an EC50 value could be detected. These results show a low flavonoid-mediated cytotoxicity in these two particular celllines. Further the antioxidative capacity of the flavonoids was measured using a cellfree system (TEAC) and a test assay based on colon carcinoma cells (DCF). In the TEAC-assay a relatively high reduction potential could be detected for all flavonoids but galangin, apigenin and chrysin and were in general confirmed by the results from the DCF-assay.
In the second part of this work the molecular effects of the used substances on the Nrf2 signaling pathway were analysed. The transcription factor Nrf2 regulates the cellular stress response by binding a consensus sequence called ARE, which is responsible for the induction of antioxidative and phase II drug metabolising enzymes and thereby modifying the cellular stress response. Tertiary butylhydroquinone (tBHQ) as an established inductor elicited as well as quercetin, kaempferol and fisetin a translocation and nuclear accumulation of Nrf2. In immunoblot analyses tBHQ showed a strong accumulation of Nrf2 in the nucleus at a concentration of 50 μM and within 30 min. 25 μM quercetin showed similar results within 4h. Kaempferol mediated a 5-fold induction of nuclear Nrf2-accumulation and Fisetin induced this accumulation already in a concentration of 5 μM within 4h either. The immunoblot results were further confirmed by using a Nrf2-GFP-fusion-construct. Analysis of the transactivation activity of Nrf2 was performed using an ARE-luciferaseplasmid. Incubation of colon cells with 50 μM tBHQ resulted in a 7-fold induction of ARE-dependent luciferase activity. Comparable to tBHQ 50 μM quercetin showed a 6,5-fold activation and fisetin was able to activate the ARE dependent luciferase activity up to 3,4-fold. Further kaempferol was able to activate the luciferase activity up to 5-fold. In a second experimental approach the expression of the Nrf2-target gene heme oxygenase 1 (HO-1) was determined by RT-PCR. tBHQ was able to induce HO-1 expression up to 3,7-fold, whereas quercetin showed only a marginal induction. The other flavonoids had no effect on HO-1 induction. These results implicate that nuclear accumulation of Nrf2 after flavonoid treatment is sufficient for binding and transactivation of an artificial ARE-consensus element but needs further components for efficient induction of endogenous target genes like HO-1. In one of the currently discussed models of Nrf2 regulation, Nrf2 bound to its inhibitor is rapidly degraded by the proteasome and therefore needs to be synthesized constitutively. Our results are in line with this model of a rapid Nrf2 turnover, as shown by the very fast nuclear Nrf2
accumulation after incubation with tBHQ and the absence of transcriptional regulation of Nrf2 by tBHQ. The detection of cytosolic Nrf2 only after inhibiting proteasomal activity by the proteasome inhibitor MG132 was in accordance with the mentioned model. Although some of the flavonoids lead to a nuclear Nrf2 enrichment this accumulation was not due to their ability to inhibit proteasomal chymotrypsin-like activity. Summarised, the results of this work showed, that flavonoids are able to modulate the redox-sensitive Nrf2 signaling pathway and can alter the cellular stress response. These findings on their molecular effects is an important step in toxicological risk assessment of flavonoids used as dietary supplements.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:06.07.2010
Dateien geändert am:02.07.2010
Promotionsantrag am:13.04.2010
Datum der Promotion:18.05.2010
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