Dokument: Molekularzytogenetische und bioinformatische Untersuchungen der FRA16B-Region beim Menschen

Titel:	Molekularzytogenetische und bioinformatische Untersuchungen der FRA16B-Region beim Menschen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15470
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100706-114517-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Karim Zad Hagh, Javad [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.07.2010 / geändert 05.07.2010
Stichwörter:	FRA16B, Human Genetik, Fragile Sites, Chromosomenbrüche, AT-reiche Regionen, Minisatelliten
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	FRA16B ist mit 5% Populationshäufigkeit die am häufigsten vorkommende RFSs in der europäischen Bevölkerung. Im Rahmen dieser Dissertation wurde mit der Etablierung von neuen molekulargenetischen, molekularzytogenetischen und bioinformatischen Methoden die Manifestation FRA16B-Region in menschlichen Zellen untersucht. Bei der Charakterisierung der Kultivierungsbedingungen wurde festgestellt, dass nicht nur Chemikalien, sondern auch eine erhöhte Temperatur von bis zu 40°C während der 72h-Kultivierung zu Chromosomenbrüchen führt. 59% dieser Brüche liegen signifikant in bekannten CFSs. Bei den FISH-Analysen zeigte sich, dass die FRA16B-Manifestation sogar in der G0-Phase vorkommt. Die Existenz der FRA16B-Expression in der G0-Phase beweist, dass die FRA16B-Expression kein Kulturartefakt ist. Hiermit muss die alte FSs-Definition, die sich bis jetzt auf die Metaphasechromosomen begrenzte, auf Interphasen erweitert werden. Im Vergleich zu der zytogenetischen Untersuchung zeigte die FISH-Analyse viele Vorteile. Ein wichtiger Vorteil der in meiner Arbeit entwickelten FISH-Sonden liegt darin, dass sie zu einer direkten und schnellen Diagnose der Fragilität an der FRA16B-Region verwendet werden können. Die Southern-Blot und PFGE-Ergebnisse von 143 untersuchten Personen (70 mental retardierte Patienten, 61 Kontrollpersonen, 6 Probanden und 6 negative Kontrollen) zeigten, dass die Expansionslänge der FRA16B-Region von 0,1kb-110kb variieren kann. Es konnte kein signifikanter Unterschied bei der Allel-Verteilung zwischen 70 mental retardierten Patienten und 61 Kontrollen nachgewiesen werden. Die PFGE-Analyse der DNA von zwei Probanden-Familien zeigte, dass die Länge der FRA16B-Expansion zwischen den Generationen stabil weitergegeben wird. Es wurde bis jetzt nur die Expansionslänge von Geschwistern untersucht. Außerdem konnte die stabile somatische Weitergabe der FRA16B-Expansionslänge in dermalen Fibroblasten und Lymphozyten bei einem FRA16B-Träger nachgewiesen werden. Proband 1 (FRA16B-Träger 1) mit einer Expansion von ca. 110kb zeigte die größte FRA16B-Expansion, die in der Literatur bisher beschrieben wurde. Außerdem konnte gezeigt werden, dass zwischen der Expansionslänge und spontaner FRA16B-Manifestation keine direkte Korrelation besteht. Die unterschiedliche FRA16B-Expression zwischen den Lymphozyten und dermalen Fibroblasten des Probanden 1, die in der FISH-Analyse gefunden wurde, unterstützt die Hypothese, dass es ein gewebspezifisches Kontrollsystem für die Manifestation von FSs gibt. Die PFGE-Ergebnisse und die zusätzlichen molekulargenetischen und FISH Analysen bei Proband 3, der klinisch auffällig war, gaben keine Hinweise auf eine Korrelation zwischen seinen Symptomen und der Expression von FRA16B. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine neue Software (AT-Block-Finder) für die Identifizierung der AT-reichen Regionen entwickelt. Die bioinformatischen Ergebnisse zeigten, dass viele dem FRA16B-Locus ähnliche Regionen im menschlichen Genom existieren (53 Loci), die meisten (90%) aber nicht in bekannten „Fragile Sites“ liegen. Damit ist klar, dass die AT-Organisation kein ausreichendes Kriterium für die FRA16B-Expression ist. The rare fragile site (RFS) FRA16B occurs in 5% (cytogenetic recognizable) of the European population and is the most frequent RFSs. In this thesis the FRA16B region has been analyzed by establishing new molecular genetic, molecular cytogenetic and bioinformatic methods. By characterization of the culture conditions I could show that not only chemicals but also increasing the temperature to 40°C within the 72h cultivation time lead to chromosome breaks. 59% of these breaks were located in known FSs. FISH-analysis showed that the manifestation of FRA16B occurs even in G0-phase. The existence of FRA16B expression in the G0-phase demonstrated that this expression is not a culture artefact but an event that can even be identified in every phase of the cell cycle. This result should lead to a new FSs definition including interphases, which is currently confined to metaphase chromosomes. Differential FRA16B expression between the lymphocytes and dermal fibroblasts from the same proband, using FISH analysis, have confirmed the distinctly tissue specific control of expression of fragile sites. In comparison to cytogenetics this work showed that FISH-analysis with the newly developed probes has many advantages, for example they can be utilized as a direct and rapid diagnosis of FRA16B fragility. Using Southern-blot and PFGE-methods I studied 143 persons (70 mentally retarded patients, 61 controls, 6 probands and 6 negative controls) to analyse the variability of this region. These results showed that the expansion length varies between 0.1-kb to 110kb. The allele distribution of FRA16B-region between 61 controls and 70 patients was not significantly different. In my thesis work I showed a stable somatic transfer of FRA16B expansion length between generations in 2 families. Furthermore, a stable somatic transfer of FRA16B expansion length (110kb) could be demonstrated in dermal fibroblasts and lymphocytes in a FRA16B carrier. An expansion of approx. 110kb in one proband showed the largest FRA16B expansion known in the literature to date. Furthermore, FISH and PFGE analyses in lymphocytes of probands have shown that there is no direct correlation between expansion length and spontaneous manifestation of FRA16B. The FISH and molecular genetic analysis of proband 3 with clinical features did not indicate a correlation between the FRA16B expression and his clinical features. For the identification of AT-rich regions, a new bio-software was developed (AT block-finder). Bioinformatic results showed that several sequences similar to the FRA16B-region exist in the human genome (53 loci). The majority (90%) of them were not located in well-known "fragile sites". So it is clear that the AT organisation alone is not a sufficient criterion for expression of a fragile site.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik
Dokument erstellt am:	06.07.2010
Dateien geändert am:	05.07.2010
Promotionsantrag am:	27.04.2010
Datum der Promotion:	16.06.2010