Dokument: Analysis of the HlyA toxin secretion system of Escherichia coli

Titel:	Analysis of the HlyA toxin secretion system of Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15468
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100701-135227-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Jumpertz, Thorsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,91 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.06.2010 / geändert 30.06.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	ABC-Transporter, Type 1 secretion system, Haemolysin A, Toxin
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	The present work examines the Type I secretion system of E. coli. In enterohaemorrhagic E. coli strains a toxin, Haemolysin A (HlyA) is secreted by the Type I machinery. This toxin has the ability to bind to the host cell membrane and leads to subsequent lysis of the attacked cells. HlyA interacts with the host cell in such way that it distrubs the membrane integrity by insertion. The size of HlyA is about 107 kDa with an extensive hydrophobic stretch at the N-terminus which makes it ideally suited to form a pore in the host cell membrane. But this is only one hypothesis how HlyA acts on cells. There are experiments describing specific receptor binding regions within the toxin and data from that it is concluded that HlyA interacts with cellular signalling pathways. The mechanism of action of HlyA is by far not understood. In this work the focus is laid on the folding of the toxin into its native form. One of the results suggests that the secretion signal has a dual function and is also responsible for proper folding of the toxin. The Type I secretion system consists of several protein that assemble into a ternary complex. Haemolysin B (HlyB, ABC transporter) and Haemolysin D (HlyD, membrane fusion protein) are located in the inner membrane. Together with the porin-like protein TolC they form a continous channel/tunnel across the periplasm to secrete the subtrate HlyA. The ABC transporter HlyB consists of a transmembrane part and a soluble nucleotide binding domain that provides the energy neccessary for transport by ATP hydrolysis. Another focus of this work is the functional characterization of the nucleotide binding domain (NBD) which explains its catalytic cycle on a molecular basis and offers a model how allostery in this protein is established. Together with the structural data derived from the crystal structure of the HlyB-NBD the biochemical data offers the possibility to test for ABC transporter inhibitors/modulators in the future since ABC transporters play a crucial role in multidrug resistance of cancer cells or different diseases like cystic fibrosis. The third part of the thesis deals with a biophysical method to measure the CMC (critical micelle concentration) value of detergents on a mid- to high-throughput scale. This is extremely useful since the CMC changes upon temperature, salt concentration and other parameters. For the purification, characterization, and crystallization of membrane proteins a screening procedure for buffers containing detergent is quite important. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse der Type I Sekretionssystems aus E. coli. In enterohaemorrhagischen E. coli Stämmen wird ein Toxin (Haemolysin A, HlyA) mit Hilfe des Type I Sekretionsapparates sekretiert. Das Toxin besitzt die Fähigkeit an die Membran der Zielzellen zu binden und die Zellen zu lysieren. HlyA interagiert dabei mit der Zielzelle, indem es die Membranintegrität durch Einlagerung zerstört. Das 107 kDa große HlyA besitzt an seinem N-Terminus einen ausgeprägten Bereich amphiphiler Helices, der es geradezu prädestiniert mit den Membranen der Zielzellen zu interagieren und in diesen eine Pore zu bilden. Dies ist allerdings nur ein Mechanismus, wie HlyA auf Zielzellen wirkt. Andere Experimente beschreiben spezifische Rezeptorbindungsstellen in HlyA über die es mit Zellen wechselwirkt und die zelluläre Signaltransduktion beeinflusst. Der endgültige Mechanismus der Funktionsweise von HlyA ist allerdings noch längst nicht verstanden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Faltung des Toxins in seine native/aktive Form. Dabei haben die Ergebnisse gezeigt, dass das Sekretionssignal am C-Ternimus von HlyA eine doppelte Funktion hat und Einfluss auf die korrekte Faltung des Toxins nimmt. Das Type I Sekretionssystem besteht aus verschiedenen Proteinen die sich ternären Komplex bilden. Der ABC-Transporter Haemolysin B (HlyB) und das Membranfusionsprotein Haemolysin D (HlyD) befinden sich in der inneren Membran. Zusammen mit den Porin-ähnlichen Protein TolC, das sich in der äußeren Membran befindet, bilden diese Komponenten einen durchgängigen Kanal beziehungsweise Tunnel, der das Periplasma durchzieht und die Sekretion des Toxins HlyA in einem Schritt über beide Membranen ermöglicht. Der ABC-Transporter HlyB besteht aus einem Transmembranteil und einer löslichen Domäne, der Nukleotidbindungsdomäne (NBD), die durch Hydrolyse von ATP für den Transport benötigte Energie zur Verfügung stellt. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit beschäftigt sich mit de funktionallen Charakterisierung der NBD, erklärt die molekularen Grundlagen des katalytischen Zyklus dieses Enzyms und bietet einen Erklärungsansatz, für die beobachtete Kooperativität in diesem Protein. Zusammen mit strukturellen Daten aus den Kristtallstrukturen der NBD bietet sich die Möglichkeit dieses intensiv charakterisierte Protein als Modellystem zu verwenden, um in Zukunft Inhibitoren/Modulatoren für ABC-Transporter zu testen, da diese Proteinfamilie eine gewichtige Rolle bei der Entstehung von multidrogenresistenten Krebszellen und verschiedenen Krankheiten wie Mukoviszidose spielt. Ein dritter Aspekt dieser Arbeit beschreibt die Etablierung einer Methode zur Bestimmung der kritischen micellaren Konzentration (CMC) von Detergenzien auf Basis einen Mittel- bis Hochdurchsatztestverfahrens. Da sich die CMC bei Änderung der Pufferbedingungen, Salzkonzentration, Temperatur und weiterer Parameter ändert, ist ein einfacher und schneller „Screen“ von Vorteil. Dies trifft insbesondere zu, wenn es um die Aufreinigung, Charakterisierung und Kristallisation von Membranproteinen geht, die sich während der gennanten Arbeitsschritte in solubilisiertem Zustand in ständigem Kontakt mit Detergenz befinden, das die Lipidumgebung der natürlichen Zellmembran nachahmen soll.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	01.07.2010
Dateien geändert am:	30.06.2010
Promotionsantrag am:	01.06.2010
Datum der Promotion:	28.06.2010