Dokument: Funktionsuntersuchung an artifiziellen [Fe-S]-Cluster bindenden Peptiden

Titel:	Funktionsuntersuchung an artifiziellen [Fe-S]-Cluster bindenden Peptiden
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=15050
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100517-142800-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hoppe, Christina Alessandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.05.2010 / geändert 17.05.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Gärtner, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibung:	Eisen-Schwefel-Cluster sind in Proteinen omnipräsente prosthetische Gruppen, die als [Fe2S2] , [Fe3S4] oder [Fe4S4] Cluster vorliegen und meist an Elektrontransfer-Reaktionen beteiligt sind. Im Verlauf der Arbeit sollen Maquettes für [Fe3S4] Cluster entwickelt werden, die eine genauere Charakterisierung dieses Clusters erlauben und Informationen über die Bindungsvoraussetzung und die Stöchiometrie liefern. Im ersten der beiden Arbeitsansätze wurde die Bindungssequenz eines Eisen-Schwefel-Clusters aus der Dimethylsulfoxidreduktase (DmsB) von E. coli mit Hilfe der Festphasenpeptidsynthese gewonnen. Des Weiteren wurden Punktmutationen analog zu bereits Literatur-bekannten Punktmutationen am vollständigen DmsB eingeführt. Die Identität und die Reinheit der erhaltenen Peptide wurden mit Hilfe von HPLC und MALDI-TOF MS bestätigt. Nach der erfolgreichen Synthese der Peptide wurde das Protokoll zur Clusterrekonstitution optimiert. Die Ergebnisse der im Verlaufe dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass bei der Clusterrekonstitution, im Widerspruch zu der gängigen Lehrmeinung, eine sukzessive Koordinierung der Eisenatome stattfindet. Der Einbau eines Clusters wurde nach Anwendung des optimierten Rekonstitutions-Protokolls durch UV/Vis-Spektroskopie bestätigt, ausserdem wurde der Clustertyp mit Hilfe der EPR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Punktmutationen wurde deutlich, dass Mutationen eines Cysteins, das Teil des Bindungsmotivs ist, einen wesentlich größeren Einfluss auf die Clusterrekonstitution hat, als die Mutation eines Cysteins, das zwar ebenfalls den Cluster koordiniert, jedoch nicht zum Bindungsmotiv gehört. Hierbei zeigte sich, dass die Größe der Aminosäure, durch die das „Bindungsmotiv“ Cystein ersetzt wurde, keinen Einfluss auf die Clusterrekonstitution hatte, wohingegen die Polarität der Aminosäure für die Clusterrekonstitution entscheidend war. Die Mutanten des „nicht Bindungsmotiv“ Cysteins zeigten Varianzen im Verhältnis von gebildetem [Fe3S4] zu [Fe4S4] Cluster in Abhängigkeit von der Polarität der eingefügten Aminosäure. Mit Hilfe der Zyklovoltammetrie ist es gelungen, das Potential eines Maquettes zu bestimmen. Die Daten der elektrochemischen Messungen bei unterschiedlichen pH-Werten weisen allerdings darauf hin, dass die Reduktion irreversibel verläuft. Außerdem konnten im Zyklovoltammogramm Effekte beobachtet werden, die auf einen Protonentransfer hindeuten. Der zweite Arbeitsansatz basiert auf dem bereits gut charakterisierten 58 Aminosäuren umfassenden Ferredoxin II von Desulfovibrio gigas, das als Mediator beim Elektronentransfer zwischen Cytochrom c3 und dem Sulfitreduktasesystem dient. Durch Vergleich des nativen Systems mit Mutanten könnte der Mutationseinfluss auf Clusterbindungseigenschaften und spektroskopische sowie elektrochemische Parameter gut beurteilt werden. Des Weiteren ist das Protein so klein, dass es als Modellsystem für komplexere Proteine dienen kann. Es ist im Verlauf der Arbeit gelungen, eine Methode am Institut zu etablieren, mit der das Ferredoxin II aus D. gigas und einige Mutanten durch Überexpression in E. coli gewonnen werden konnten. Mit Hilfe der UV/Vis-Spektroskopie wurde nachgewiesen, dass ein Eisen Schwefel Cluster in das jeweilige Protein rekonstituiert werden konnte.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	17.05.2010
Dateien geändert am:	17.05.2010
Promotionsantrag am:	14.01.2010
Datum der Promotion:	28.04.2010