Dokument: Aufnahme und Metabolismus von Flavonoiden in Zellkultursystemen und im Rattenmodell

Titel:	Aufnahme und Metabolismus von Flavonoiden in Zellkultursystemen und im Rattenmodell
Weiterer Titel:	Absorption and metabolism of flavonoids in cell culture systems and the rat
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=14567
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100422-093714-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Ruhl, Sven [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.04.2010 / geändert 01.04.2010
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ernährung, die stark auf pflanzlichen Produkten basiert, wird epidemiologisch mit einer reduzierten Inzidenz von unterschiedlichen degenerativen Krankheiten und Krebs korreliert. In den letzten Jahren entstand daher ein großes Angebot an polyphenolhaltigen Nahrungsergänzungsmitteln und sogenanntem „Funktional Food“. Wissen über die Bioverfügbarkeit und den Metabolismus von Flavonoiden sowie die pharmakologischen Wirkungen der Metabolite sind essentiell um die tatsächlich bioaktiven Substanzen zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Aufnahme strukturverwandter Flavonoide sowie deren Metabolitenprofile in verschiedenen Zellkultursystemen charakterisiert. Die maximale intrazelluläre Konzentration von 2 ng Flavonoid/µg Protein wurde schon nach kurzer Inkubationszeit (15 min) erreicht. Die Verwendung pharmakologischer Transportinhibitoren bzw. die Inkubation bei 4°C führte zu keiner Veränderung der intrazellulären Flavonoidkonzentrationen. Dadurch konnte exemplarisch für Quercetin eine Beteiligung des aktiven Transports an der Flavonoidhomöostase in den verwendeten Zellkultursystemen ausgeschlossen werden. Quercetin und Luteolin, welche orthoständige Hydroxylgruppen im B-Ring aufweisen, wurden von der Hepatomzelllinie HepG2 und der Kolonkarzinomzelllinie Hct116 in die Methoxyderivate Isorhamnetin bzw. Chrysoeriol oder Diosmetin umgesetzt. Die Methylierung im B-Ring bewirkte eine Abnahme des antioxidativen Potentials bei zeitgleich erhöhter Toxizität der Verbindungen. Die Induktion der Apoptose war bei beiden 3´-Methoxyderivaten, im Vergleich mit den Ausgangssubstanzen, in der HepG2- bzw. Hct116 Zelllinie stärker (DNA-Fragmentations-Assay, Anstieg der Caspase-3/7-Aktivität). Eine Behandlung der HepG2 Zellen mit Isorhamnetin erhöhte zusätzlich die Anzahl nekrotischer Zellen (Laktat-Dehydrogenase-Aktivität, Propidiumiodid-Färbung). Die Luteolinderivate zeigten mit diesen Methoden keine Erhöhung der Nekroserate der Hct116 Zellen. Eine differentielle Phosphorylierung der MAPKinasen JNK und p38 in HepG2 Zellen durch eine Inkubation mit Quercetin bzw. Isorhamnetin konnte, mit Hilfe der Immunoblot-Methode, ausgeschlossen werden. Eine Reduktion der ERK-Phosphorylierung konnte für beide Substanzen, ab einer Konzentration von 5 µM (2 h Inkubation) und ab einer Inkubationsdauer von 30 Minuten (50 µM), nachgewiesen werden. Bei höheren Konzentrationen (> 50 µM) reduzierte Isorhamnetin die TNF-α induzierte NFκB-Aktivität stärker als Quercetin. In Aufnahmeversuchen mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans konnte erstmals eine Aufnahme des Flavonoids Quercetin in den Fadenwurm nachgewiesen werden. Neben der Detektion des Quercetins im Lysat der Fadenwürmer (HPLC) konnte auch eine selektive Aufnahme des Quercetins in die Darmzellen des Nematoden gezeigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zelluläre Effekte von Catechinderivaten untersucht. Aufnahmestudien mit Epigallocatechingallat (EGCG) in Hct116 und HepG2 Zellen ergaben eine zeitabhängige Aufnahme des Catechinderivates in beide Zelllinien. Es konnten in den Hct116 Zellen zwischen 0,5 µg EGCG/mg Protein (1 h) und 1,1 µg EGCG/mg Protein (6 h) detektiert werden. Die intrazellulären Konzentrationen in den HepG2 Zellen waren signifikant niedriger. Dies könnte als Hinweis auf spezielle Zielgewebe im Organismus gedeutet werden. Eine Inkubation der Hct116 Zellen bei 4°C führte zu einer deutlich niedrigeren Catechinakkumulation in den Zellen (0,04 ng/µg Protein vs. 0,4 ng/µg Protein nach 4 h), was eine aktive Aufnahme des Flavanols durch einen Transporter nahelegt. Eine wiederholte Exposition von trächtigen Ratten mit EGCG (1000 mg/kg) führte zu großen individuellen Unterschieden in der detektierten Flavonoidmenge. Die höchsten Konzentrationen wurden in der Leber (bis 154 µg EGCG/g Feuchtgewicht) und den Lungen (bis 208 µg EGCG/g Feuchtgewicht) nachgewiesen. In den Gehirnen akkumulierte deutlich weniger EGCG (maximal 1,1 µg EGCG/g Feuchtgewicht). Nur im Blut eines Tieres konnte EGCG nachgewiesen werden. Somit liegt eine gewebespezifische Akkumulation des EGCGs in den Tieren nahe. Die Gehirnhomogenate der potentiell exponierten Neugeborenen zeigten, im Vergleich zu nicht exponierten Tieren, ein verändertes Chromatogramm. Die Identität des zusätzlichen Peaks konnte jedoch nicht geklärt werden. Das veränderte Chromatogramm legt den Übergang des Catechinderivates bzw. eines seiner Metabolite in das Gehirn der Föten bzw. Neugeborenen nahe. Die Interaktion von Flavonoiden mit intrazellulären Signalwegen bei niedrigen Konzentrationen (5 µM) und kurzen Inkubationszeiten (0,5 h) sind ein Hinweis für eine potentielle Wirkung der Flavonoide unter physiologischen Bedingungen auf den Menschen. Des Weiteren ist zu beachten, dass durch Metabolismus entstandene Derivate zum Teil eine erhöhte Zytotoxizität besitzen. Die Verwendung der Flavonoide als Nahrungsergänzungsmittel sollte daher, und aufgrund der gefundenen, teilweise hohen Gewebekonzentrationen sowie dem Übertritt des Epigallocatechingallats bzw. eines Metaboliten auf das Ungeborene, kritisch bewertet werden. There is an increasing supply of dietary supplements rich in polyphenols. This is due to a correlation of a nutrition based on fruits and vegetables containing high amounts of these substances with a lower incidence of degenerative diseases and cancer in some epidemiological studies. However, the bioavailability and metabolism of polyphenols and knowledge on pharmacological effects of those metabolites are essential to identify biological active compounds. Therefore, we first examined the uptake and metabolism of related flavonoids in different cell-culture systems. Our results showed that the maximum concentration (2 ng flavonoid/µg Protein), which was detected intracellular, occurred within 15 minutes. Neither coincubation with different pharmacological transportinhibitors nor incubation at 4 °C altered the intracellular concentrations of flavonoids. Hence, involvement of transporters regulating the intracellular concentrations of flavonoids seems to be unlikely as shown for quercetin. Flavonoids possessing ortho-hydroxylgroups in the aromatic ring B (quercetin and luteolin) were methylated into the respective methylderivatives isorhamnetin and chrysoeriol or diosmetin. In HepG2 and Hct116 cells both 3´-methoxyderivatives exerted a higher toxicity than the parent compounds. This was accompanied by an induction of apoptosis (DNA-fragmentation-assay, caspase-3/7-activity). Isorhamnetin also increased necrotic cell death (lactate-dehydrogenase-assay, propidiumiodide-staining) in HepG2 cells while both methylderivatives of luteolin were not able to induce necrosis in Hct116 cells. Using immunoblotting-methods no alteration in phosphorylation of the MAPkinases JNK and p38 were observed. Incubation with 5 µM quercetin and isorhamnetin (2 h), respectively, as well as incubation with both substances for 0,5 h (50 µM) decreased the phosphorylation of the MAPkinase ERK. Isorhamnetin reduced TNF-α mediated NFκB-activity in higher concentrations (> 50 µM). This effect was slightly superior compared to quercetin. An uptake of the flavonoid quercetin into the model organism Caenorhabditis elegans was shown for the first time. Beside the detection of quercetin in lysates of the nematode by means of HPLC-methods the accumulation in intestinal cells was proofed additionally. The second part of the thesis dealt with cellular effects of catechinderivatives. Epigallocatechin gallate (EGCG) was taken up in a time-dependent manner into Hct116 and HepG2 cells. In Hct116 cells 0,5 ng EGCG/µg protein (1 h) up to 1,1 ng EGCG/µg protein (6 h) were detected, while HepG2 cells accumulated significant lower amounts of the catechinderivative (0,4 ng EGCG/µg protein after 6 h). This could imply specific target tissues in the body accumulating high amounts of this compound. Incubation of Hct116 cells with EGCG at 4°C significantly lowered the intracellular catechin concentrations (0,04 vs. 0,4 ng EGCG/µg Protein), indicative for an active absorption into the cells. Exposing pregnant rats to EGCG (1000 mg/kg) led to high interindividual differences in catechin concentrations. Liver and lung (up to 154 and 208 µg EGCG/g wet weight, respectively) showed the highest concentrations of EGCG. The concentrations found in brain were far lower (maximum 1,1 µg/g wet weight) and only one blood sample showed detectable amounts of EGCG. Thus, an accumulation of EGCG in specific tissues seems to be likely. Newbornes of treated rats showed a different pattern in the HPLC-chromatogram compared to newborns of non-treated rats. Identity of this peak could not be proven. However, appearance of this additional peak in chromatograms of potentially exposed newborns suggests a transfer of EGCG or a metabolite from the mother to the embryonic system. Interactions of flavonoids with intracellular signaling pathways in low concentrations (5 µM) and after short incubation times (0,5 h) implicate potential effects of flavonoids on human health even under physiological conditions. The higher toxicity of some metabolites needs further attention with respect to a dietary supplementation with polyphenols. Aditionally, the high concentrations found in different tissues as well as the transfer into the embryonic system should lead to a critical examination of a dietary supplementation with polyphenols.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	22.04.2010
Dateien geändert am:	01.04.2010
Promotionsantrag am:	18.12.2009
Datum der Promotion:	25.01.2010