Dokument: Generierung und Charakterisierung humaner Hepatitis C Virus (HCV) -spezifischer Antikörperfragmente und Analyse des Einflussesvon HCV auf die Expression zelluärer Proteine

Titel:	Generierung und Charakterisierung humaner Hepatitis C Virus (HCV) -spezifischer Antikörperfragmente und Analyse des Einflussesvon HCV auf die Expression zelluärer Proteine
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=14379
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100309-102320-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Karthe, Juliane [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.03.2010 / geändert 08.03.2010
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Weltweit leiden schätzungsweise 170 Millionen Menschen an einer chronischen HCV Infektion. Obwohl in der medikamentösen Therapie zur Behandlung der chronischen HCV Infektion große Fortschritte gemacht wurden, ist es weiterhin nicht möglich, bestimmte Subgruppen, wie Patienten mit Infektion des Genotyps 1, mit hoher Virämie oder dem Vorliegen einer Zirrhose, erfolgreich zu behandeln. Das Hepatitis C Virus hat nicht nur effiziente Strategien zur Umgehung der antiviralen Immunantwort entwickelt, sondern interagiert auch mit einer Vielzahl von wirtseigenen Faktoren um einen effizienten Ablauf des viralen Lebenszyklus zu ermöglichen und hierdurch in seiner Wirtszelle zu persistieren. Obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl von Mechanismen aufgeklärt wurden, durch die HCV die zelluläre Infrastruktur für seine eigene Replikation nutzt, sind zahlreiche Aspekte der Interaktion von HCV mit dem Wirt nur unzureichend verstanden. Im ersten Teil der Arbeit wurden mit Hilfe der Phage-Display-Technologie HCV Core-spezifische Antikörperfragmente isoliert, charakterisiert und detailliert analysiert. Die Affinitätsselektion, die gegen ausgewählte Peptide verschiedener Regionen des HCV Core Proteins erfolgte, führte zwar zur Anreicherung hochaffiner Antikörperfragmente, aber nicht zur erfolgreichen Isolierung von funktionell relevanten Antikörpern. Effizienter in der Generierung inhibitorischer Einzelkettenantikörperfragmente zeigte sich die Affinitäts-selektion gegen das vollständige HCV Core Protein. Es konnte das Antikörperfragment Sc42 isoliert werden, das sowohl in vitro als auch in vivo an das HCV Core Protein bindet. In Kolokalisationsstudien ist deutlich erkennbar, dass der Sc42 in Anwesenheit des Core Proteins sein zytoplasmatisches Verteilungsmuster verliert und die gleiche vesikuläre, perinukleäre Expression wie das HCV Core Protein aufweist. Hiermit übereinstimmend konnte auch mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Technik (FRET) eine intrazelluläre Protein-Protein-Interaktion nachgewiesen werden. In weiteren Analysen wurde eine Prolin-reiche Sequenz (PWPLYG) innerhalb des Core Proteins als putatives Bindungs-epitop des Sc42 identifiziert. Die intrazelluläre Interaktion des Sc42 mit dem HCV Core Protein führt sowohl zur Verminderung der Core Proteinexpression als auch zur Reduktion Core-bedingter, pathologischer Effekte, wie der Verringerung der Zellproliferationsrate und könnte somit die Ausgangsbasis für die Entwicklung eines HCV Wirkstoffes bilden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Proteinexpressionsprofil von Lebergewebe NS3/4A-transgener Mäuse im Vergleich zu wildtypischen Mäusen mit Hilfe der 2D-DIGE-Gelektro-phoresetechnik analysiert. Insgesamt konnten 18 differentiell exprimierte Proteine identifiziert werden, die aufgrund ihrer Funktion in fünf Klassen gruppiert wurden. Darunter sind mit 44 % Stoffwechsel-assoziierte Proteine, mit 28 % Proteine des Lipid- und Lipoproteinstoffwechsels und mit 17 % Proteine der ER-Homöostase vertreten. Eine untergeordnete Rolle spielten Proteine des Zytoskeletts und der Signaltransduktion. Ein Protein, das in den transgenen Tieren herabreguliert war und damit als potenzielles Substrat der NS3/4A Protease in Frage kommt, war Apolipoprotein E. Untersuchungen auf RNA- und Proteinebene ergaben allerdings eine erhöhte Expression von ApoE in den HCV-assoziierten Zelllinien. Mit Hilfe von Fluoreszenz-Analysen konnte belegt werden, dass Apolipoprotein E mit den nicht-strukturellen Proteinen NS3 und NS4A, aber nicht mit NS5A und NS5B im Golgi-Komplex kolokalisiert. Damit wurde erstmalig das zelluläre Wirtsprotein ApoE als putativer Inter-aktionspartner des viralen Proteinkomplexes NS3/4A identifiziert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	09.03.2010
Dateien geändert am:	08.03.2010
Promotionsantrag am:	05.08.2009
Datum der Promotion:	01.12.2009