| Beschreibungen: | Mit Autodisplay steht ein System zur Verfügung, das die Präsentation eines funktionellen Passagierproteins auf der Oberfläche von E. coli Zellen ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die carboxyterminale Aminosäure (Phenylalanin) der β-Fass-Domäne des Autodisplay-Systems ausgetauscht. Sie wurde mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese durch Tryptophan, Tyrosin, Histidin oder Valin ersetzt oder vollständig deletiert. Aromatische Aminosäuren konnten ohne Funktionsverlust gegeneinander getauscht werden. Durch Untersuchungen an der Valin-Mutante (hydrophob, aber nicht aromatisch) wurde nachgewiesen, dass die Integration oder der Transport, aber nicht die Konformation des Proteins beeinträchtigt war. Wurde die C-terminale Aminosäure deletiert, konnte kein außenmembranständiges Protein detektiert werden. Damit konnte ein direkter Einfluss der Aromatizität des C-Terminus auf die Integration in die äußere Membran nachgewiesen werden. Im Laufe der Zeit kam es durch Evolution und Selektion zu sieben Aminosäureaustauschen in den Transportdomänen. Die Mutationen hatten keinen Einfluss auf die in dieser Arbeit untersuchten Eigenschaften des Autodisplay, wie beispielsweise die Menge an oberflächenständigem Passagier. Durch Überexpression entstanden zwei unterschiedliche Proteinformen. Nur eine Form zeigte das für β-Fass Proteine typische Verhalten der Hitzedenaturierung und präsentierte ihre Passagierdomäne auf der Oberfläche. Die andere Form befand sich in einer nicht funktionellen Konformation und transportierte den Passagier nicht über die äußere Membran. Durch eine Analyse der N-terminalen Proteinsequenz wurde nachgewiesen, dass nur das funktionelle Protein durch die Signalpeptidase prozessiert worden war. Durch Solubilisierung im Detergenz N-Lauryl-Sarcosinat-Natrium gelang es, die beiden Formen voneinander zu trennen. Das funktionelle Protein verhielt sich dabei genau wie das als Indikatorprotein dienende natürliche Außenmembranprotein OmpA, das ebenfalls ein β-Fass ausbildet. Die Proteinexpression konnte durch Änderung der Induktionsbedingungen soweit optimiert werden, dass nur noch die funktionelle Variante gebildet wurde und ohne dass die Faltung der Struktur oder die Zahl der oberflächenständigen Passagiermoleküle beeinträchtigt war. Durch die Koexpression der periplasmatischen Chaperone SurA, FkpA, DsbA und DsbC konnte die Menge an oberflächenständigem Protein verdoppelt werden.Autodisplay represents a system which enables the presentation of a functional passenger protein on the surface of E. coli cells. In the context of this thesis the carboxyterminal amino acid (phenylalanine) of the β-barrel-domain of the autodisplay system was exchanged. With the help of site-directed mutagenesis, phenylalanine was deleted or replaced by tryptophane, tyrosine, histidine or valine. Aromatic amino acids could be changed against each other without a loss of function. Through analysis of the valine-mutant (hydrophobic, but not aromatic) it was demonstrated that the integration or the transport, but not the conformation of the protein was affected. If the C-terminal amino acid was deleted, no protein could be detected on the surface of the outer membrane. Therefore, the aromaticity of the C-terminus proved to be of direct influence on the integration in the outer membrane. In the course of time seven amino acid exchanges occurred in the transport domains of the autodisplay due to evolution and selection. No influence of the mutated amino acids on the analysed characteristics of the autodisplay, e.g. the amount of surface displayed passenger, could be substantiated. Due to overexpression two different protein forms were generated. Only one of them displayed the typical behaviour of β-barrel proteins, such as thermal denaturation, and enabled the presentation of the passenger domain on the surface. The other form was situated in a nonfunctional conformation and was not able to transport the passenger across the outer membrane. Through analysis of the N-terminal protein sequence of both variants it was possible to verify that only the functional protein was processed by the signal peptidase. It was possible to separate the two forms through solubilization in the detergent N-lauroyl-sarcosinate-sodium. Thereby, the functional protein displayed the same behaviour as the common outer membrane protein OmpA, which represents a typical β-barrel protein and was used as a control. The protein expression could be optimized through changes in the induction conditions to such an extend that only functional protein was generated without impairment of structural functionality or amount of passenger molecules on the surface. Through coexpression of the periplasmic chaperones SurA, FkpA, DsbA and DsbC a twofold increase of surface exposed passenger protein could be achieved.
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