Dokument: Das Cyclophilin EtCyp20.5 aus Eimeria tenella als Rezeptor für das Antikokzidium Toltrazuril

Titel:	Das Cyclophilin EtCyp20.5 aus Eimeria tenella als Rezeptor für das Antikokzidium Toltrazuril
Weiterer Titel:	The cyclophilin EtCyp20.5 from Eimeria tenella as receptor for the anticoccidium toltrazuril
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=14075
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101126-090554-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat. Bierbaum, Stefan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.02.2010 / geändert 10.02.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Frank Wunderlich [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Cyclophilin, Tolrazuril, Eimeria tenella
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Geflügel-Kokzidiose ist eine parasitäre Darmerkrankung bei Hühnern, die insbesondere in der industriellen Masttierhaltung zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führt. Eimeria tenella ist der am stärksten pathogene Erreger dieser Krankheit im Haushuhn. Ein Meilenstein in der Entwicklung von Kokzidiostatika stellt Toltrazuril (Baycox®) dar, ein symmetrisches Triazinonderivat, das heute weltweit zur Behandlung eines breiten Spektrums von Parasitosen eingesetzt wird. Bislang ist kein molekulares Target für Toltrazuril in Eimeria tenella bekannt. Ziel der Arbeit war es, ein Target für Toltrazuril mittels Phagen Displays zu identifizieren und zu charakterisieren. Es konnten zwei neue Cyclophiline aus E. tenella erstmals identifiziert und enzymatisch aktiv in E. coli rekombinant exprimiert werden. Diese Arbeit präsentiert ein 20,5 kDa großes Cyclophilin, EtCyp20.5, als neuen potentiellen Rezeptor für Toltrazuril in E. tenella. Ein Protease gekoppelter PPIase-Assay und ein RNase T1 Rückfaltungs-Assay konnten erfolgreich etabliert werden, um die Enzymaktivität zu bestimmen (kkat (PPIase) = 0,087 ± 0,01) und Hemmstudien mit verschiedenen Inhibitoren durchzuführen. Beide Cyclophiline, EtCyp20.5 und EtCyp18.7 ließen sich wie erwartet durch den spezifischen Inhibitor Cyclosporin A (CsA) konzentrationsabhängig inhibieren (IC50 = 12nM bzw. 18nM). Die Enzymaktivität von EtCyp20.5 konnte überraschenderweise auch durch die Zugabe von Toltrazuril gehemmt werden (IC50 = 1,84 µM). Diese Hemmung erwies sich als spezifisch, da weder das EtCyp18.7 durch Toltrazuril inhibiert werden konnte, noch eine der anderen getesteten Substanzen einen Effekt auf EtCyp20.5 zeigte. Die gemessenen IC50-Werte entsprachen Literaturwerten von in Zellkultur verwendeten Mengen an Toltrazuril und Ponazuril, die eingesetzt werden, um Schäden an suszeptiblen Parasiten auszulösen. Durch Fluoreszenzmessungen konnte gezeigt werden, dass sich die Wirkung von Toltrazuril deutlich von den CsA-vermittelten Effekten unterscheidet, da die CsA-Bindungstasche, bzw. das für die Bindung essentielle Tryptophan offenbar nicht von Toltrazuril genutzt wird. Diese Arbeit identifiziert erstmals das Cyclophilin EtCyp20.5 aus dem Parasiten Eimeria tenella als ein spezifisches Target für Toltrazuril und bietet damit einen neuen Ansatzpunkt zur Klärung des molekularen Wirkmechanismus von Toltrazuril und zum ´design´ neuer Kokzidiostatika in der Pharmaindustrie. Avian coccidiosis is an important disease causing enormous economic losses, in particular in poultry farms. Typical symptoms are haemorrhagic diarrhea associated with reduced egg production and a dramatic loss of weight. If not medicated, the animals die. Eimeria tenella is the most pathogenic causative agent of coccidiosis in the domestic chicken Gallus gallus. A milestone in the development of coccidiostats is toltrazuril (Baycox®), a symmetric triazinonederivative which is currently used worldwide against a wide variety of diseases. To date the major target for toltrazuril still remains to be elucidated. The aim of his Ph. D. thesis was the identification of a molecular target for toltrazuril by using the phage display method. Two new cyclophilins from E. tenella were identified and expressed enzymatically active in E. coli cells. This work presents a 20.5 kDa cyclophilin, EtCyp20.5, as a new putative receptor for toltrazuril in Eimeria tenella. A protease coupled PPIase assay and a RNase T1 refolding assay were successfully established to determine the enzyme activity (kcat (PPIase) = 0.087 ± 0.01) and to perform inhibition assays. As expected, both cyclophilins, EtCyp18.7 and EtCyp20.5, were inhibitable by the specific cyclophilin inhibitor cyclosporine A (CsA) in a concentration dependent manner (IC50 = 12nM and 18nM respectively). Surprisingly, the enzyme activity of EtCyp20.5 was also inhibitable by toltrazuril (IC50 = 1.84 µM). This effect seems to be specific, since the EtCyp18.7 was not inhibited by toltrazuril and non of the other substances that were tested revealed any effect on EtCyp20.5. The IC50-values were comparable to concentrations used to induce damages in the close related parasites T. gondii and N. caninum in cell culture. By fluorescence measurements the interaction of CsA and toltrazuril with the CsA-binding pocket was investigated. However, it seems that the CsA-binding pocket, in particular the critical tryptophane, interacts not with toltrazuril. This thesis identifies the cyclophilin EtCyp20.5 as a specific drug target for toltrazuril. Moreover, this protein represents a new starting point for discovering the mode of action of toltrazuril in Eimeria tenella or the design of novel coccidiostatica by the pharmaceutical industry
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Molekulare Parasitologie
Dokument erstellt am:	26.11.2010
Dateien geändert am:	10.02.2010
Promotionsantrag am:	01.10.2006
Datum der Promotion:	03.02.2010