Dokument: Genetische Analyse von Substrat-Translokase-Wechselwirkungen bei der Tat-abhängigen Proteintranslokation in Escherichia coli

Titel:	Genetische Analyse von Substrat-Translokase-Wechselwirkungen bei der Tat-abhängigen Proteintranslokation in Escherichia coli
Weiterer Titel:	Genetic analysis of substrate-translocase interactions during Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13960
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100202-100917-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lausberg, Frank [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,24 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.02.2010 / geändert 01.02.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Stichwörter:	twin-arginine, tat-abhängige Proteintranslokation, Proteinsekretion, Export
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der bakterielle Tat-Weg ist ein alternativer Weg für Proteine über die Cytoplasmamembran. Die Signalpeptide von Tat-Substraten besitzen ein konserviertes Sequenzmotiv mit dem Konsensus SRRxFLK. Das Zwillingsarginin (RR) ist hierbei beinahe invariabel und essentiell für eine effiziente Erkennung/Bindung des Tat-Signalpeptids an der Tat-Translokase. Durch eine genetische Selektion konnten Kreutzenbeck et al. (2007) mit den N-Termini von TatC und TatB zwei Bereiche in der Tat-Translokase identifizieren, die an der Bindung/Erkennung von Tat-Signalpeptiden beteiligt sind. Hierzu verwendeten sie eine Variante des hoch sensitiven TorA-MalE-Reporterproteins, die aufgrund des Austausches des Zwillingsarginins zu Lysin-Glutamin (KQ) im Tat-Konsensus-Motiv des TorA-Signalpeptids exportdefekt ist. Alle Suppressormutationen dieses TorA[KQ]-MalE-Reporters, sogenannte KQ-Suppressormutationen, lagen in den erwähnten Bereichen der Tat-Translokase. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substrat-Translokase-Interaktion bei der Tat-abhängigen Proteintranslokation in Escherichia coli ausgehend von der Phenylalanin-Position untersucht, da diese neben den beiden Argininen die am höchsten konservierte Aminosäure im Tat-Konsensus-Motiv ist. Es konnte gezeigt werden, dass im TorA-Signalpeptid ein Serin und ein Arginin an der Phenylalanin-Position platziert werden können, ohne dass dies einen größeren negativen Einfluss auf die Effizienz des Tat-abhängigen Exports hat. Dennoch konnte gezeigt werden, dass nicht jede beliebige Aminosäure an der Phenylalanin-Position toleriert wird und dass diese Position eine kritische Determinante für die Erkennung/Bindung des TorA-Signalpeptids an der Tat-Translokase darstellen kann. Der Austausch des Phenylalanins gegen das negativ geladene, hydrophile Aspartat wurde nicht toleriert und führte zu einem kompletten Exportblock dieses TorA[F14D]-MalE-Reporters. Im Folgenden konnte gezeigt werden, dass der Exportdefekt des TorA[F14D]-MalE-Reporters durch ausgewählte KQ-Suppressormutationen, wenn zumeist auch nur schwach, supprimiert wird. Zudem konnten vier neue Suppressortranslokasen isoliert werden, in denen sich die selektierten Suppressormutationen ebenfalls, wie alle KQ-Suppressormutationen, in den N-Termini von TatB und TatC befanden. Für diese Suppressormutationen konnte gezeigt werden, dass sie auch den Exportdefekt des TorA[KQ]-MalE-Reporters schwach supprimieren. Da alle untersuchten Suppressormutationen sowohl den Exportdefekt des TorA[F14D]-MalE- und des TorA[KQ]-MalE-Reporters supprimieren, bedeutet dies, dass keine dieser Suppressormutationen eine spezifische Bindung des Aspartats im TorA[F14D]-MalE- oder des Lysin-Glutamin im TorA[KQ]-MalE-Reporter durch die Tat-Translokase verursacht, sondern eine neue oder stärkere Bindung der Translokase zu einer anderen Position im Tat-Signalpeptid. Anhand von verschiedenen Suppressortranslokasen, in denen zwei und in einem Fall sogar drei Suppressormutationen kombiniert vorlagen, konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Suppressormutationen in einer Tat-Translokase einen synergistischen Effekt auf die Effizienz der Suppression des Exportdefektes des TorA[F14D]-MalE- und des TorA[KQ]-MalE-Reporters hat. Dieser Effekt wurde sowohl bei der Kombination von zwei Suppressormutationen aus dem TatC N-Terminus, aber interessanterweise auch bei der Kombination von Suppressormutationen aus dem TatB N-Terminus mit Suppressormutationen aus dem TatC N-Terminus beobachtet, was ein starker genetischer Hinweis darauf ist, dass der TatB N-Terminus und der TatC N-Terminus bei der Bindung/Erkennung von Tat-Signalpeptiden kooperieren. Die Lage der Suppressormutationen in den N-Termini von TatB und TatC lässt hierbei auf eine durch TatB und TatC gemeinsam gebildete Signalpeptidbindetasche schließen, an der ein Tat-Signalpeptid über mehrere Kontakte gebunden wird. Schließlich konnte gezeigt werden, dass alle einfach, zweifach und auch dreifach mutierten Suppressortranslokasen immer noch in der Lage waren, den unveränderten TorA-MalE-Reporter zu exportieren. Allerdings wurde bei allen Suppressortranslokasen, die eine bestimmte Suppressormutation im TatB N-Terminus beinhalten, eine reduzierte Exporteffizienz des unveränderten TorA-MalE-Reporters beobachtet. Dieses lässt auf eine Veränderung der postulierten Signalpeptidbindetasche durch diese Mutation schließen, die dazu führt, dass das unveränderte TorA-Signalpeptid durch diese mutierten Tat-Translokasen nun schlechter erkannt wird oder aus sterischen Gründen nun schlechter an die Signalpeptidbindetasche binden kann. Ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Komponenten der Tat-Translokase. Es wurde eine Tat-inaktivierende Mutation in TatC, von der bekannt ist, dass sie die Interaktion von TatB und TatC im TatBC-Rezeptorkomplex stört, verwendet um Tat-gekoppelte Suppressormutationen zu isolieren. Es wurden zwei Suppressortranslokasen identifiziert, die jeweils zwei Mutationen beinhalten, die für die Suppression der Tat-inaktivierenden Mutation in TatC verantwortlich sind. Die Lage der Suppressormutationen deutet darauf hin, dass die TatB Transmembranhelix, ein bestimmter Bereich in der cytoplasmatischen Domäne von TatB, und der extreme N-Terminus von TatC offensichtlich an den Wechselwirkungen zwischen TatB und TatC im TatBC-Rezeptorkomplex beteiligt sind. The bacterial Tat pathway (twin arginine translocation) is an alternative pathway for proteins across the cytoplasmic membrane. The signal peptides of Tat substrates carry a conserved sequence motif with the consensus SRRxFLK. Here the twin arginine (RR) is almost invariable and is essential for an efficient recognition/binding of the Tat signal peptide to the Tat translocase. Using a genetic selection, Kreutzenbeck et al. (2007) identified the N-terminal domains of TatB and TatC as regions in the Tat translocase that are involved in the recognition/binding of Tat signal peptides. For this purpose, they used a variant of the highly sensitive TorA-MalE reporter protein that is export-defective due to the replacement of the twin arginine by a lysine-glutamine (KQ) pair. All suppressor mutations of this TorA[KQ]-MalE reporter (so-called KQ-suppressor mutations) were located in these regions of the Tat translocase. In the present work, substrate-translocase interaction during Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli was investigated starting from the consensus phenylalanine residue, because the latter is the most highly conserved residue in the Tat consensus motif apart from the twin arginine. It was shown that it was possible to place a serine or arginine at the consensus phenylalanine position without causing any serious negative impact on the efficiency of the Tat-dependent translocation. However, it was also shown that not every amino acid is tolerated at the consensus phenylalanine position and that this position can be a critical determinant for the recognition/binding of the TorA signal peptide to the Tat translocase. The replacement of the consensus phenylalanine by the negatively charged and hydrophilic aspartate was not tolerated and led to a complete export defect of this TorA[F14D]-MalE reporter. It was demonstrated that the TorA[F14D]-MalE export defect can be suppressed by chosen KQ-suppressor mutations, albeit only weakly. Additionally, four new Tat-coupled suppressor translocases were isolated, in which all the selected suppressor mutations were found, in the same way as all the KQ-suppressor mutations in the extreme N-terminal domains of TatB and TatC. For these newly identified suppressor mutations it was shown that they also weakly suppress the export defect of the TorA[KQ]-MalE reporter. Due to the fact that all investigated suppressor mutations suppress the export defect of both the TorA[F14D]-MalE and the TorA[KQ]-MalE reporter, it is apparent that none of the suppressor mutations causes a specific recognition of the aspartate in the TorA[F14D]-MalE or the lysine-glutamine in the TorA[KQ]-MalE reporter by the Tat translocase, but rather that they cause a new or a stronger binding from the Tat translocase to the signal peptide at a non-consensus phenylalanine and a non-twin arginine position. By means of different suppressor translocases that carry two or, in one case, three suppressor mutations in combination, it was shown that the combination of suppressor mutations in one Tat translocase have a synergistic effect on the efficiency of the suppression of the export defect of the TorA[F14D]-MalE and the TorA[KQ]-MalE reporter. This effect was observed when two suppressor mutations from the TatC N-terminal domain were combined and, interestingly, also when suppressor mutations from the TatB N-terminal domain were combined with suppressor mutations from the TatC N-terminal domain, which is strong genetic evidence that the TatB N-terminal domain and the TatC N-terminal domain cooperate in the process of Tat signal peptide binding/recognition. The localization of the suppressor mutations at the N-terminal domains of TatB and TatC strongly suggests the presence of a signal peptide binding pocket formed by TatB and TatC where a signal peptide is bound over several contacts. Finally, it was shown that all single-, double- and threefold-mutated Tat translocases were still able to export the unaltered TorA-MalE reporter. However, all suppressor translocases that carried a certain suppressor mutation in the N-terminal domain of TatB displayed a reduced export efficiency of the unaltered TorA-MalE reporter. This implies an alteration in the postulated signal peptide binding pocket due to the mutation, which then leads to an impaired recognition of the unaltered TorA signal peptide or to a hindered binding of the unaltered TorA signal peptide to the signal peptide binding pocket for steric reasons. Another concern of this work was the investigation of the interactions between the components of the Tat translocase. A Tat-inactivating mutation in TatC, which is known to disrupt the interactions between TatB and TatC, was used to isolate Tat-coupled suppressor mutations. Two different suppressor translocases were identified that both carry two mutations responsible for the suppression of the Tat-inactivating mutation in TatC. The location of the mutations indicates that the TatB transmembrane helix, a distinct region in the cytoplasmic domain of TatB, and the extreme N-terminal domain of TatC are involved in the interactions between TatB and TatC in the TatBC receptor complex.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtl. Gründen bis 31.12.2010 gesperrt, soll bis Ende Okt. veröff. werden
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	25.10.2010
Dateien geändert am:	01.02.2010
Promotionsantrag am:	17.08.2009
Datum der Promotion:	05.11.2009