Dokument: Identifizierung und Charakterisierung von Adhäsionsproteinen des humanpathogenen Erregers Chlamydia pneumoniae

Titel:	Identifizierung und Charakterisierung von Adhäsionsproteinen des humanpathogenen Erregers Chlamydia pneumoniae
Weiterer Titel:	Identification und characterization of adhesion proteins of the human pathogen Chlamydia pneumoniae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13936
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100203-093334-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Murra, Gido [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.01.2010 / geändert 27.01.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Simon, Rüdiger [Gutachter]
Stichwörter:	Chlamydia, Adhäsin, Invasion, Endozytose, Infektion, SNX9
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydiaceae sind Gram-negative, obligat intrazelluläre Bakterien, wobei vor allem die Spezies Chlamydia trachomatis und Chlamydia pneumoniae ein breites Spektrum an Erkrankungen bei Mensch und Tier auslösen. C. trachomatis Serovare sind die häufigste Ursache für sexuell übertragbare Erkrankungen weltweit. C. pneumoniae verursacht Infektionen des respiratorischen Traktes die zur Ausbildung von Pneumonien, Bronchitis und Sinusitis führen und wird mit chronischen Erkrankungen wie Asthma und Arteriosklerose assoziiert. C. pneumoniae Infektionen sind häufig und abhängig vom Alter haben 50 – 80 % der Bevölkerung Antikörper gegen C. pneumoniae entwickelt, aufgrund eines Kontaktes mit dem Erreger. Im Laufe des biphasischen Entwicklungszyklus treten Chlamydien in Form infektiöser, metabolisch inaktiver Elementarkörperchen (EBs) und nicht-infektiöser, metabolisch aktiver Retikularkörperchen (RBs) auf. Für die Etablierung der C. pneumoniae Infektion ist die Adhäsion infektiöser EBs der erste initiale Schritt, der zur Aufnahme der Chlamydien führt. Für C. pneumoniae konnten bislang nur wenige Proteine identifiziert werden, die an der Adhäsion beteiligt sind. Für das Adhäsin OmcB wurde ein Heparinbindemotiv identifiziert, mit dem es an Glykosaminoglykane der Wirtszelle bindet (Moelleken and Hegemann 2008). Auch das C. pneumoniae Chaperon GroEL1 und der Auto-transporter Pmp21 zeigen Adhäsion an Humanzellen, wobei im Falle von Pmp21 charakteristische Motive eine prominente Rolle spielen, jedoch sind die humanen Interaktionspartner noch unbekannt (Wuppermann, Molleken et al. 2008) (Schmidt 2009). Viele Pathogene nutzen jedoch multiple Eintrittspforten für die Infektion, was die Existenz entsprechender bakterieller Adhäsine voraussetzt. Daher existieren auch für C. pneumoniae vermutlich weitere Adhäsin-Rezeptor Kombinationen, die für eine spezifische Adhäsion chlamydialer EBs an verschiedene Zelltypen verantwortlich sind. Ausgehend von einer genomweiten Transkriptanalyse wurden in der vorliegenden Arbeit weitere C. pneumoniae Adhäsine identifiziert, die für eine Spezies-spezifische Bindung an Humanzellen verantwortlich sind. Eine Beladung infektiöser EBs spät im chlamydialen Entwicklungszyklus, mit Proteinen die eine wichtige Rolle in der Adhäsion und Internalisierung in einer neuen Infektions-runde einnehmen, diente dabei als Arbeitshypothese für die Analyse differentiell exprimierter Gene. Basierend auf Microarray-Transkriptdaten wurde daher das spät in der Infektion exprimierte Gencluster Cpn0678 – Cpn0676 untersucht. Die drei Gene zeigten ein koreguliertes Genexpressionsmuster und wurden als neues C. pneumoniae Operon identifiziert. Hefezellen, die auf ihrer Oberfläche die Proteine Cpn0678, Cpn0677 oder Cpn0676 exprimieren, zeigten Adhäsion an humane HEp-2 Zellen. Latexkügelchen beschichtet mit rekombinantem Cpn0678 oder Cpn0677-Protein zeigten ebenfalls eine Adhäsion an HEp-2 Zellen. Cpn0678, Cpn0677 und Cpn0676 sind EB-spezifische Proteine, deren Lokalisation erstmalig nach 60 h und damit in der späten Infektion mikroskopisch detektierbar war und sich nur auf die Chlamydien innerhalb der Inklusion beschränkte. Während der Adhäsion und Internalisierung von infektiösen EBs zeigten Cpn0678 und Cpn0677 eine Kolokalistion mit dem Außenmembranprotein MOMP und lokalisieren damit auf der EB-Oberfläche. Die Oberflächenlokalisation von Cpn0678 und Cpn0677 wurde durch biochemische und FACS-Analysen bestätigt. Eine Vorbehandlung von EBs mit einem spezifischen Cpn0678- und Cpn0677-Antikörper führte zu einer signifikanten Reduktion der Infektion. Während rekombinantes Cpn0678 (rCpn0678) nur Adhäsion zeigte, konnte rCpn0677 zusätzlich noch die eigene Aufnahme in humane HEp-2 Zellen vermitteln, da mit rCpn0677 beschichtete Latexkügelchen und auch lösliches Protein internalisiert wurden. Zudem deuten erste Daten darauf hin, dass mit rCpn0677 und rCpn0678 beschichtete Latexkügelchen die Bildung von F-Aktin Taschen induzieren. In GST-Pulldown und Crosslinking Experimenten konnte eine Interaktion von rCpn0677 und rCpn0678 mit dem humanen Sorting Nexin 9 (SNX9) Protein gezeigt werden, welches ein zentrales Protein an der Schnittstelle von Clathrin-vermittelter Endozytose und damit assoziierter Reorganisation des Aktinzytoskeletts darstellt. Mit Hilfe einer SNX9 „knock-down“-Zelllinie sowie Neutralisationsexperimenten mit einem spezifischen SNX9-Antikörper wurde erstmals eine funktionelle Rolle von SNX9 für die C. pneumoniae Infektion gezeigt. Somit wurde in dieser Arbeit das neue C. pneumoniae Operon Cpn0678 - Cpn0676 identifiziert und eine Funktionsanalyse der hypothetische Proteine Cpn0678 – Cpn0676 durchgeführt. Die C. pneumoniae spezifischen Proteine Cpn0678 und Cpn0677 lokalisieren auf der Oberfläche infektiöser EBs und vermitteln Adhäsion, wobei Cpn0677 zusätzlich noch Internalisierung vermittelt. Beide Proteine sind durch eine Interaktion mit humanem SNX9 möglicherweise an der Verknüpfung von Aktinassemblierung und Membranremodellierung während der Endozytose von C. pneumoniae beteiligt. Chlamydiaceae are obligate intracellular Gram-negative bacteria and are associated with a wide variety of infections in humans and animals. C. trachomatis serovars are the leading cause for sexually transmitted diseases worldwide. C. pneumoniae causes infections of the respiratory tract leading to pneumoniae, bronchitis and sinusitis and is associated with chronic diseases like asthma and atherosclerosis. Infections with C. pneumoniae are very common and 50 – 80 % of the population show detectable antibody levels as a result of contact with the pathogen. During the biphasic developmental cycle Chlamydia exist as infectious, metabolically inactive elementary body (EB) und as non-infectious, metabolically inactive reticulate body (RB). The establishment of the C. pneumoniae infection requires adhesion of infectious EBs, in combination with the secretion of effector proteins to modulate host cell function, leading to uptake of the pathogen. A few C. pneumoniae proteins with a role in adhesion have been identified so far. The adhesin OmcB mediates adhesion to glycosaminoglycans on human cell via a heparin binding motif (Moelleken and Hegemann 2008). The C. pneumoniae chaperone GroEL1 and the autotransporter Pmp21 show adhesion to human cells and Pmp21 contains characteristic repetitive motifs that play an important role, but the human interaction partners of these proteins remain unknown until now (Wuppermann, Molleken et al. 2008) (Schmidt 2009). In this study new C. pneumoniae adhesins were identified that mediate species-specific adhesion to human cells. Gene products expressed during the late-stage of infection might represent a potential source of entry-related proteins, as proteins synthesized in RBs could be retained within EBs and contribute during subsequent infection events. Based on microarray transcript data the late expressed gene cluster Cpn0678 – Cpn0676 was identified and the three genes showed a co-regulated expression pattern and represent a new C. pneumoniae operon. Yeast cells surface expressing Cpn0678, Cpn0677 or Cpn0676 mediate adhesion and additionally Cpn0678 or Cpn0677 coated latex beads bind to human HEp-2 cells. Cpn0678, Cpn0677 and Cpn0676 represent EB-specific proteins that are detected microscopically starting from 60 h post infection and are found solely within the chlamydial inclusion. During adhesion and internalization of infectious EBs a colocalization of Cpn0678 and Cpn0677 with the outer membrane protein MOMP was observed, indicating a surface localization for these proteins. The surface localization of Cpn0678 and Cpn0677 was further substantiated by biochemical and FACS analysis. The functional inhibition of Cpn0678 and Cpn0677 by pre-incubation of infectious EBs with specific antibodies led to a significant decrease of infectivity. Whereas recombinant Cpn0678 (rCpn0678) mediates only adhesion, rCpn0677 is able to induce internalization. Soluble rCpn0677 and rCpn0677 coated latex beads were internalized showing that Cpn0677 displays a function in adhesion and internalization. Preliminary data showed that rCpn0677 and rCpn0678 coated latex beads led to the formation of F actin rings beneath attached beads. GST-pulldown and crosslinking experiments showed an interaction of Cpn0678 and Cpn0677 with the human protein sorting nexin 9 (SNX9). SNX9 plays a central role during clathrin-mediated endocytosis and the reorganization of the actin cytoskeleton. Experiments with SNX9 knock-down cells and neutralization studies with a specific SNX9-antibody resulted in a significant reduction of infection, showing for the first time a functional role of SNX9 in the C. pneumoniae infection. In summary the new C. pneumoniae operon Cpn0678 - Cpn0676 was identified and a functional analysis of the hypothetical proteins Cpn0678, Cpn0677 and Cpn0676 was performed. The C. pneumoniae specific proteins Cpn0678 and Cpn0677 are located on the surface of infectious EBs and mediate adhesion and Cpn0677 also mediates internalization. These proteins are possibly involved in linking actin assembly and membrane remodeling during endocytosis of C. pneumoniae through an interaction with the human SNX9 protein.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtl. Gründen bis 30.07.2010 zurückgestellt
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	20.08.2010
Dateien geändert am:	27.01.2010
Promotionsantrag am:	30.11.2009
Datum der Promotion:	20.01.2010