Dokument: Gewebe-spezifische RNAi und Analyse von Intermediärfilament Proteinen in
| Titel: | Gewebe-spezifische RNAi und Analyse von Intermediärfilament Proteinen in | |||||||
| Weiterer Titel: | Tissue-specific RNAi and analysis of intermediatefilament proteins in Caenorhabditis elegans | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13883 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100121-113625-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Wiesenfahrt, Tobias [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Stichwörter: | C. elegans, RNAi, Intermediärfilamente | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | RNAi (RNA-vermittelte Interferenz) ist eine effektive Methode, um die Genfunktion gezielt herunterzuregulieren. Dazu wird doppelsträngige RNA eingesetzt, um die komplementäre mRNA komplett abzubauen. Bisher gab es in C. elegans jedoch keine Möglichkeit RNAi Organ-spezifisch anzuwenden. Daher wurde im ersten Kapitel dieser Arbeit ein transgener C. elegans Stamm, OLB11, generiert und getestet, in dem RNAi nur im Darm funktioniert. Dazu wurde unter der Kontrolle des Darm-spezifischen elt-2 Promoters eine Pluskopie des rde-1 Gens im Hintergrund der RNAi-insensitiven Mutante rde-1(ne219) exprimiert. Der C. elegans Darm bildet eine „einfache“ Röhre, die aus lediglich 20 Zellen besteht, und ist hervorragend geeignet zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Epithelentwicklung. So gelang es in OLB11 die Funktion der epithelialen Gene dlg-1, ajm-1 und let-413 gezielt im Darm auszuschalten. Im Gegensatz zum Wildtyp führt dies nicht zu embryonaler, sondern larvaler Letalität. Darm-spezifische RNAi gegen früh exprimierte, maternale Gene konnte keinen sichtbaren Phänotyp induzieren. Am Bespiel von par-3 konnte gezeigt werden, dass ein Grund dafür wahrscheinlich die „Stabilität“ früh synthetisierter Proteine ist. RNAi gegen cyb-3, welches für ein Zyklin kodiert und während des Zellzyklus schnell auf- und abgebaut wird, führte in OLB11 erstaunlicherweise auch zu Defekten in Nicht-Darmzellen. Dies könnte auf eine bisher nicht beschriebene Diffusion sekundärer siRNAs im C. elegans Embryo hinweisen. In weiteren Darm-spezifischen RNAi Experimenten wurde dann die Funktion des ELT-2 Transkriptionsfaktors und des IFB-2 Intermediärfilament-Proteins (IF) während der Larval- und Adultentwicklung herunterreguliert und die resultierenden Phänotypen ausgewertet.
IF bilden neben Aktinfilamenten und Mikrotubuli die dritte, am wenigsten erforschte Komponente des Zytoskeletts. Regulations-Mechanismen zu ihrer Organisation sind nahezu unbekannt und sollten im zweiten Kapitel dieser Arbeit mit Hilfe eines transgenen ifb-2::cfp Reporterstamms näher untersucht werden. Im C. elegans Darmepithel werden sechs IF exprimiert, die wahrscheinlich alle subapikal in der Endotube, einer speziellen, elektronendichten Struktur des Terminalgeflechts, lokalisieren. RNAi führte nur im Falle von ifc-2, zu einem Phänotyp, der sich durch Blasen-förmige Invaginationen der apikalen Membran in das Zytoplasma der Zellen auszeichnet. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion von IFC-2 bei der Organisation der Endotube hin. In einem EMS-Mutagenese Screen, der mit dem ifb-2::cfp Reporterstamm durchgeführt wurde, konnten dann zwei Allele (kc2, kc3) des ifo-1 (intermediate filament organizer) Gens isoliert, kartiert und kloniert werden. IFO-1 ist der erste in C. elegans identifizierte Organisator für IF und lokalisiert zusammen mit IFC-2 und IFB-2 in der Endotube der Darmzellen. In ifo-1 kommt es zur Fehlverteilung der beiden IF, die nun um die interzelluläre Kontaktstruktur, die so genannte „C. elegans apical junction“ und im Zytoplasma akkumulieren. Durch eine weitere, detaillierte Analyse des ifo-1 Phänotyps konnten dann gravierende Defekte bezüglich der Organisation des Aktinzytoskeletts aufgedeckt werden. Das Ezrin-Radixin-Moesin Homolog ERM-1 in C. elegans interagiert genetisch mit IFO-1. So treten nach erm-1 RNAi in der ifo-1 Mutante nicht nur die Einzel-Phänotypen auf, sondern ein dritter, der auf Defekte bei der Zell-Zelladhäsion des Darmepithels hindeutet.RNAi (RNA-mediated interference) is an effective method to specifically down regulate gene function using doublestranded RNA to degrade the complementary mRNA. So far it was not possible to apply RNAi only to a certain tissue in C. elegans. Hence, in the first chapter of this thesis a transgenic C. elegans strain, OLB11, was generated and intensely tested that allows intestine-specific RNAi. Therefore a wild type copy of the rde-1 gene was expressed under control of the intestine-specific elt-2 promoter in the RNAi-insensitive rde-1(ne219) mutant. The C. elegans intestine consists of only 20 cells, which form a simple tube and is ideally suited to study fundamental mechanisms of epithelial development. Intestine specific RNAi against epithelial genes (dlg-1, ajm-1 and let-413) induced larval lethal phenotypes instead of embryonic arrest. Depletion of early maternally expressed proteins did not induce any phenotypes in OLB11, probably due to perduring maternal protein, as demonstrated by immunostaining against PAR-3. In contrast, intestine-specific RNAi against cyclin B3 (cyb-3), which is quickly synthesized and degraded during the cell-cycle, surprisingly led to defects in non-intestinal cells also. As a possible mechanism the diffusion of secondary siRNAs in the C. elegans embryo is discussed. In additional RNAi experiments the function of the ELT-2 transcription factor and the intermediate filament protein (IF) IFB-2 was then analyzed during larval and adult development of OLB11. While numerous investigations focused on the characterization of microtubules and the F-actin network, comparatively little is known about the organization and regulating mechanisms of IFs in living organisms. In the second chapter of this thesis a transgenic ifb-2::cfp reporter strain was used to analyze the role of intestine-specific IFs, of which IFB-2 and IFC-2 localize subapically in the endotube, a specific electron dense structure of the terminal web. Only after RNAi against ifc-2 bubble-like invaginations of the apical membrane into the cytoplasm appeared, suggesting a key role of IFC-2 for correct lumen formation. Next, a classical F2 EMS-mutagenesis-screen was performed, to identify mutants with aberrant IFB-2::CFP expression patterns. Two alleles (kc2, kc3) of the ifo-1 (intermediate filament organizer) gene were isolated, mapped and cloned. IFO-1 is the first IF organizer identified in C. elegans, which co-localizes with IFB-2 and IFC-2 at the endotube. In ifo-1 IFs become mislocalized, now accumulating at the intercellular junction and in the cytoplasm. Furthermore, a detailed analysis of the ifo-1 phenotype then revealed severe defects in the organization of the F-actin cytoskeleton. In C. elegans ifo-1 genetically interacts with the ezrin-radixin-moesin homolog erm-1, another F-actin organizer. RNAi against erm-1 in the ifo-1 mutant background, in addition to the single phenotypes, generates a third, new phenotype that suggests loss of cell-cell adhesion in the intestine. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.01.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.01.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.12.2009 | |||||||
| Datum der Promotion: | 07.01.2010 |
