| Beschreibungen: | Der hier untersuchte Organismus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (DvMF) ist seit langem bekannt auf Grund detaillierter Untersuchungen an seiner [NiFe] Hydrogenase und an Sulfat-Stoffwechselproteinen sowie einiger anderer Metallo-Enzyme, die in Zusammenhang mit den Hydrogenasen stehen. Unabhängig von den relativ guten Ausbeuten, die man für diese Proteine erzielt, ist die funktionale und genetische Manipulation schwierig, da die Sequenzen der kodierenden Gene nicht bekannt waren sind. In dieser Arbeit wurden genetische und molekularbiologische Fortschritte erzielt und weitere Informationen über den Stoffwechsel der Hydrogenasen von DvMF erhalten. Das gesamte Genom von DvMF wurde in eine Cosmid-Bank kloniert. Die Verwendung von dioxygenin-markierten DNA-Sonden aus bekannten homologen Sequenzen von D. vulgaris Hildenborough (DvH) führte zur Identifizierung der gesuchten Gene. Sie kodieren zwei zusätzliche Hydrogenasen, eine aus zwei Untereinheiten bestehende [NiFeSe] Hydrogenase (hysA und hysB) und eine sechs Untereinheiten große Ech Hydrogenase (echA - echF). Zusätzlich wurden die Gensequenzen für fünf „Maturierungs“-Proteine aufgeklärt (hypA - hypF). Diese Methode wurde auch angewandt auf die Gene von Proteinen des Sulfatmetabolismus, 5'-Adenylyl Sulfatreduktase (aprA und aprB) und Desulfoviridin (dsvA, dsvB, dsvD und DsvC). Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist der eindeutige Nachweis, dass ein [FeFe] Hydrogenase-kodierendes Gen in DvMF nicht vorhanden ist. Methodisch wurden sämtliche Gene sequenziert, indem mittels degenerierter "primer" aus identifizierten, konservierten Genbereichen heraus sequenziert wurde. Die Gene der [NiFe] - und der [NiFeSe] - Hydrogenasen wurden zusammen mit den Maturierungsgenen Epitop-getaggt. Die Verwendung von E. coli als Wirtszelle mit einem T7-Promotor Expressionsvektor ergab die Reinigung von Strep-getaggter [NiFe] Hydrogenase, die Integration von Selenocystein in die [NiFeSe] Hydrogenase und die gleichzeitige Expression von zwei-Gen operons (hypAB und hypDE). Hiermit wurden wichtige Fortschritte hin zu einer heterologen Expression von physiologisch aktiven Hydrogenasen erzielt. Zusätzlich zu den Untersuchungen an Hydrogenasen konnten in gemeinsamer Arbeit die Protein-Komplexe der 5'-Adenylyl-sulfatreduktase und von Desulfoviridin gereinigt und kristallisiert werden. Regulatorische Sequenzen der Gene wurden mit verschiedenen Programmen detektiert, ebenfalls wurden dreidimensionale Modelle für die Proteine generiert und eine phylogenetische Analyse durchgeführt.The studied organism Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (DvMF) has long been known from detailed investigations of its [NiFe] hydrogenase, of its proteins involved in sulfate metabolism proteins and of some other metallo-enzymes associated with hydrogenases. Although the yields of such proteins from DvMF are high, the functional and genetic manipulations have been a daunting task due to non-availability of the sequences of the coding genes. In this work, genetic and molecular biological advances have been made to add on information on hydrogenase metabolism of DvMF. The entire genome of DvMF was cloned into a cosmid genomic library. Probing by means of dioxygenin-labeled DNA probes derived from the known homologous sequences of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) led to the identification of several genes of focus. These genes included two additional hydrogenases, a two subunit [NiFeSe] hydrogenase (hysA and hysB) and a six subunit Ech hydrogenase (echA, echB, echC, echD, echE and echF), as well as five maturation genes hypA, hypB, hypD, hypE and hypF. This method was extended to sequence the genes coding for the sulfate metabolism proteins 5’-adenylyl sulfate reductase (aprA and aprB) and desulfoviridin (dsvA, dsvB, dsvD and dsvC). The presence of an [FeFe] hydrogenase could be ruled out. All of the identified genes were sequenced by designing degenerate primes from the conserved domains. The [NiFe]- and [NiFeSe]- hydrogenases along with maturation gene operons were epitope tagged by means of PCR and cloning. Using E. coli as a host along with a T7 promoter expression vector, the purification of strep-tagged [NiFe] hydrogenase, integration of selenocysteine into the [NiFeSe] hydrogenase and the simultaneous expression of two-gene operons (hypAB and hypDE) of hyp maturation genes happened to be significant observations for advancing in the direction of heterologous expression and modification of hydrogenases in physiological functional forms. In addition to the work aiming at hydrogenases, the protein complexes of 5’-adenylyl sulfate reductase and desulfoviridin were purified and crystallized in a collaborative effort. Using various software, the possible regulatory sequences for the sequenced genes, the three dimensional models for the translated proteins and the phylogenetic analysis based on amino acid sequence conservation were also successfully performed.
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