Dokument: Nachweis einzelner krankheits-assoziierter Proteinaggregate als diagnostische Methode für Prionkrankheiten
| Titel: | Nachweis einzelner krankheits-assoziierter Proteinaggregate als diagnostische Methode für Prionkrankheiten | |||||||
| Weiterer Titel: | Detection of single disease-associated protein aggregates as a diagnostic method for prion diseases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13814 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100126-113846-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr Henke, Franziska [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Diagnose; Prionen; konfokale Fluoreszenzmikroskopie; Biomarker | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) ist eine übertragbare neurodegenerative Krankheit. Der Erreger besteht hauptsächlich aus dem fehlgefalteten körpereigenen Prion-Protein (PrPCJD), welches in aggregierter Form vorliegt. Derzeit gibt es keine molekulare Diagnostik für CJD, die in der Lage ist, den Erreger im präsymptomatischen Stadium nachzuweisen. Die meisten Schnelltests zur Diagnose von Prionkrankheiten bei Tieren beruhen auf der Proteinase K (PK)-Resistenz des Erregers. Seitdem bekannt ist, dass der größte Anteil des PrPCJD PK-sensitiv ist, sollte in Bezug auf Sensitivität auf einen Proteolyseschritt verzichtet werden.
Ziel dieser Arbeit war es eine molekulare Diagnostik für CJD zu entwickeln. Da sich das zelluläre PrP (PrPC) chemisch nicht von PrPCJD unterscheidet, musste eine krankheits-assoziierte Eigenschaft herangezogen werden. Der Aggregationszustand wurde als diagnostischer Marker gewählt. Zum Aggregatnachweis eignete sich die Methode Surface-FIDA. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Surface-FIDA grundlegend methodisch optimiert und im Hinblick auf eine molekulare Diagnostik für CJD angewandt. Der Ansatz beinhaltet die Immobilisierung von Prion-Proteinaggregaten auf einer Glasoberfläche. In einem ersten Optimierungsschritt wurde der Capture-Antikörper mittels eines heterobifunktionellen Spacers kovalent an die Glasoberfläche einer Microtiterplatte gebunden. Nach der Reinigung von PrPCJD aus Hirngewebe von CJD-Patienten konnte so eine Capture-vermittelte Bindung von PrPCJD nachgewiesen werden. Viele fluoreszenzmarkierte Sonden können an die PrPCJD-Aggregate binden, woraus hochfluoreszente Partikel resultieren. Diese wurden mittels Laserscanning-Mikroskopie visualisiert. Mit einer neu etablierten Auswertung der Bilddaten konnten einzelne fluoreszente Partikel quantifiziert werden. Nach der systematischen Optimierung des Protokolls zur Immobilisierung und Detektion von PrPCJD, konnten CJD-positive Proben von CJD-negativen Proben mit 100-prozentiger Sensitivität und Spezifität unterschieden werden. Erste Sensitivitätsbesimmungen zeigen, dass 40 μg an CJD-positiven Hirngewebe verdünnt in CJD-negativem Hirngewebe ausreichten, um PrPCJD zu detektieren.Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) is a transmissible neurodegenerative disease. The causative agent consists mainly of the host-encoded misfolded prion protein (PrPCJD) and is present in form of insoluble aggregates. Currently, no molecular presymptomatic diagnostic test for CJD is available, which is based on the detection of the pathogen itself as unequivocal biomarker. Most rapid tests for diagnosis of prion diseases in animals are based on the proteinase K (PK)-resistance of PrPCJD. Since it is known that most of the PrPCJD is PK-sensitive, a diagnostic assay, which does not rely on proteolysis is desirable. The aim of this work was to develop a molecular diagnostic test for CJD. Because the cellular PrP (PrPC) does not differ chemically from PrPCJD, disease-associated properties had to be drawn on. Therefore the aggregated state was chosen as a diagnostic marker. For the detection of aggregates the method of surface-FIDA was available. A part of this work was to optimize surface-FIDA in its methodology and to adapt it as a diagnostic test for CJD. The surface-FIDA assay involves the immobilization of prion protein aggregates on a glass surface. In a first optimization step the capture antibody was bound covalently to the glass surface of a microplate by using a heterobifunctional spacer. After precipitating PrPCJD from brain tissue of CJD victims a capture-mediated binding of PrPCJD could be achieved. Multiple fluorescence labeled probes can bind to the PrPCJD aggregates resulting in highly fluorescent particles. These particles were visualized by laser scanning microscopy. With a newly established image analysis single particles could be quantified. After optimizing the protocol for the immobilization and detection of PrPCJD systematically, CJD-positive samples can be distinguished from CJD-negative samples with 100% sensitivity and specificity. Preliminary experiments concerning sensitivity show that 40 ng of CJD-positive brain tissue diluted in CJD-negative brain tissue were sufficient to detect PrPCJD. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 26.01.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.01.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.11.2009 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.12.2009 |
