Dokument: Charakterisierung des Kalzium- und Integrin-bindenden Proteins CIB1 als Regulator von Chronophin
| Titel: | Charakterisierung des Kalzium- und Integrin-bindenden Proteins CIB1 als Regulator von Chronophin | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterisation of the calcium- and integrin binding protein CIB1 as a regulator of Chronophin | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13544 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20100702-151148-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hoffmann, Axel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gohla, Antje [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Dynamik der Aktinfilament-Organisation ist essentiell für die Entwicklung und Funktion eukaryoter Organismen und wird daher durch eine Vielzahl Aktin-bindender Proteine räumlich und zeitlich strikt reguliert. Dabei gilt der ubiquitär exprimierte Aktin-depolymerisierende Faktor Cofilin als Schlüsselregulator der Stimulus-induzierten Aktin-Zytoskelett-Dynamik. Die Cofilin-aktivierende Phosphatase Chronophin (CIN), ein neuartiges Mitglied der HAD-Superfamilie von Protein-Phosphatasen in Säugern, spielt in kultivierten Zellen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Aktin-Zytoskeletts während der Zellmigration und Mitose. Die Regulation der CIN-Aktivität auf zellulärer Ebene ist jedoch noch völlig unverstanden. Ein primäres Ziel dieser Arbeit war es daher, Regulatoren von CIN zu identifizieren und zu charakterisieren, um grundlegende Einblicke in CIN-regulierende Signaltransduktionswege zu erhalten.
Von unserer Arbeitsgruppe wurde das Kalzium- und Integrin-bindende Protein 1 (CIB1) im Rahmen eines yeast two-hybrid screens als putativer CIN-Interaktor identifiziert. Im Verlauf dieser Dissertation wurde die direkte und spezifische Bindung der beiden Proteine biochemisch mit Hilfe von rekombinanten, gereinigten sowie mit endogenen Proteinen nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Assoziation von CIN und CIB1 in vitro durch physiologisch relevante Ca2+-Konzentrationen moduliert wird. CIB1 ist darüber hinaus in der Lage, eine Ca2+-vermittelte Inhibierung der CIN-Phosphataseaktivität gegen das niedermolekulare Substrat Pyridoxal-5´-phosphat (PLP) konzentrationsabhängig und über einen weiten Ca2+-Bereich hinweg aufrecht zu erhalten. Durch eine Sequenzanalyse wurde eine theoretische Bindestelle des Kalziumsensors Calmodulin auf CIB1 identifiziert. In der anschließenden biochemischen Analyse konnte nachgewiesen werden, dass sowohl CIB1 als auch CIN in vitro Ca2+-abhängig an Calmodulin binden können. Interessanterweise resultierte das Zusammenspiel von CIN, CIB1, Calmodulin und Ca2+ in einer signifikanten Stimulation der CIN-Phosphataseaktivität gegen PLP. Dieser Befund stellt CIN in eine Reihe mit Calcineurin, der bisher einzigen bekannten Ca2+-abhängigen Protein-Phosphatase. Durch Mutationsanalysen wurde im Verlauf dieser Arbeit eine essentielle Bindungsstelle von CIB1 auf CIN1 lokalisiert. Dies resultierte in der erfolgreichen Etablierung eines Peptids, das die CIB1/CIN-Interaktion in vitro spezifisch blockieren kann. Somit steht nun für weiterführende zelluläre Analysen ein vielseitiges experimentelles Werkzeug zur Verfügung, mit dem die Interaktion von CIN und CIB1 spezifisch inhibiert werden kann. Durch Untersuchungen in mitotischen Zellen konnte gezeigt werden, dass CIN und CIB1 während der Mitose und Zytokinese in Bereichen gesteigerter Aktin-Dynamik kolokalisieren. Die Phosphocofilin-Profile nach siRNA-vermittelter CIN- und CIB1-Depletion deuten auf eine wichtige Rolle von CIB1 bei der Regulation der CIN-Aktivität während der Mitose hin. Dementsprechend konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CIB1 und CIN zu Zellteilungsstörungen und zu einer verstärkten Akkumulation multinukleärer Zellen führt. Somit scheint die Ca2+-abhängige CIB1/CIN-Interaktion eine wichtige Rolle bei der CIN-vermittelten Cofilin-Aktivierung und Aktin-Dynamik während der Mitose zu spielen. Zusammen legen unsere Befunde die Hypothese nahe, dass es sich bei CIB1 (analog zur Assoziation von Calcineurin B mit der katalytischen PP2B-Untereinheit Calcineurin A) um eine Strukturkomponente von CIN handelt.The dynamic reorganisation of the actin cytoskeleton is essential for the development and function of eukaryotic organisms and is therefore tightly controlled in space and time by numerous actin binding proteins. Proteins of the ADF/cofilin family are key regulators of actin cytoskeletal dynamics, and their activity is inhibited by phosphorylation of a single serine residue. Our group has recently identified Chronophin (CIN), a novel ADF/cofilin-specific phosphatase with unique structural and biochemical properties that is a member of the largely unexplored family of haloacid dehalogenase (HAD)-type hydrolases. CIN plays an important role in the regulation of cofilin-dependent actin dynamics during cell motility and division. Currently, nothing is known about CIN regulatory proteins. Therefore, the goal of this study was to elucidate mechanisms by which CIN activity is regulated to gain insights into the dynamics of cytoskeletal reorganisation. A yeast two-hybrid screen was performed by our group in order to identify CIN-regulatory proteins. This screen resulted in the identification of the calcium- and integrin binding protein 1 (CIB1) as a putative CIN interactor. CIB1 shares a significant strucural similarity to the non-catalytic subunit of protein phosphatase 2B/calcineurin. This dissertation work demonstrates that CIB1 is able to directly and specifically interact with CIN in vitro, as shown by biochemical pulldown and solid phase binding experiments, using both purified, recombinant and endogenously expressed proteins. For an in-depth analysis of the CIN/CIB1 interaction a monoclonal CIN- and a polyclonal CIB1-specific antibody was generated and validated. Furthermore, solid phase binding experiments with purified proteins revealed a calcium-dependent association of CIN and CIB1 in vitro, resulting in a markedly stimulated CIN phosphatase activity towards the CIN-specific low molecular weight compound pyridoxal-5`-phosphate. Moreover, both CIN and CIB1 were able to specifically interact with the calcium sensor calmodulin (CaM) in a calcium-dependent manner in vitro. The interplay of CIN, CIB1, CaM and calcium led to a significantly enhanced activity of CIN towards PLP. Interestingly, the composition of the CIN/CIB1 complex bears a striking resemblance with the serine/threonine-phosphatase calcineurin, a master regulator of important signaling cascades governing development and function of the immune, nervous and cardiovascular system. So far, Calcineurin has been believed to be unique among phosphatases in its ability to sense calcium through its activation by calcium. The binding site of CIB1 on CIN was mapped in yeast two-hybrid assays to a discrete region of 5 amino acids, and a region of 13 amino acids in the C-terminus of CIB1 was identified as critical for CIN binding. Both regions are surface exposend and were confirmed as important interaction sites in solid phase binding experiments using a truncated CIB1 protein and a synthetic peptide derived from CIN. This peptide was able to inhibit the association of CIN and CIB1 with high efficiency, thus presenting a valuable tool for future studies addressing the biological roles of the CIB1/CIN interaction. Evidence for a physiological relevance of the CIN/CIB1 interaction was obtained by subcellular localisation studies using confocal microscopy. In mitotic cells, CIN and CIB1 colocalised to regions of dynamic actin cytoskeletal reorganisation, e.g. the ingressing cleavage furrow during telophase or dynamic membrane areas during the later phases of cytokinesis. Here, knockdown of CIN and CIB1 protein levels by RNA interference in mitotic GC-1 spg cells lead to increased phospho-cofilin levels during cytokinesis and a significantly enhanced accumulation of multinucleated cells. Therefore, the Ca2+-dependent CIB1/CIN-interaction appears to play an important role fort he CIN-mediated cofilin activation and actin reorganisation during mitotic cell division. In analogy to the association of the structural subunit Calcineurin B with the catalytic subunit Calcineurin A, our results suggest that CIB1 constitutes a structural component of CIN. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 02.07.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 07.12.2009 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.07.0009 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.11.0009 |
