Dokument: Crystallisation and Structure Solution of the c-Ring of FoF1 ATP Synthase from Spinach Chloroplasts

Titel:	Crystallisation and Structure Solution of the c-Ring of FoF1 ATP Synthase from Spinach Chloroplasts
Weiterer Titel:	Kristallisation und Strukturbestimmung des c-Rings der FoF1 ATP Synthase von Spinatchloroplasten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12721
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100525-154134-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Vollmar, Melanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,09 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.04.2010 / geändert 11.04.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	ATP Synthase, c-Ring, Fo, Rotor, Membranpotential, Protonengradient
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die ATP Synthase aus Spinat gehört zu einer Gruppe von essentiellen Proteinen, die den größten Teil an ATP in einer Zelle produzieren. Die in Licht gespeicherte Energie wird von den photosynthetisch aktiven Komplexen genutzt, um einen nach Außen gerichteten Elektronen-/Protonengradienten über die Thylakoidmembran der Chloroplasten aufzubauen. Diese Energetisierung der Membran ist die Voraussetzung für eine aktive FoF1 ATP Synthase. Diese pumpt im Gegenzug die Protonen in den Chloroplasten. Während dieses Transportprozesses, wird die elektrische Energie des Gradienten in die mechanische Energie einer Rotation übersetzt. Diese Rotation findet im Membranteil Fo statt, und wird über einen Stab in den membranassozierten Teil F1 weiter gegeben, der die katalytisch aktiven Bindungstaschen trägt. Konformationsänderungen in diesen Bindungstaschen resultiert in der Ausbildung einer Anhydridbindung zwischen den Substraten ADP und anorganischem Phosphat, um ATP zu produzieren. Für F1 ist bereits eine detaillierte Struktur bekannt, und sowohl Reaktionsmechanismus als auch der Aufbau der Bindungstaschen sind auf atomarer Ebene gelöst. Die Methode der Röntgenkristallanalyse wurde in dieser Arbeit genutzt, um die Struktur des Hauptbestandteils von Fo, den protonentransportierenden Rotor aus Untereinheit c, aufzuklären. Dies gelang mit einer Auflösung von 3.8 Å. In dieser Arbeit wird die erste detaillierte Struktur des rotierenden Rings einer protonentranslozierenden ATP Synthase vorgestellt. Diese Struktur kann genutzt werden, um Ergebnisse zu Bindungsverhalten sowie vorgeschlagene Strukturdetails und Mechanismen zu erklären. Mit Änderungen in den Kristallisationsbedingungen, an die Kristallisation anschließende Manipulationen und allgemeine Verbesserungen in der Reinigung wurde versucht die Auflösung zu verbessern und eine detailliertere Struktur zu erhalten. Kristalle, die unter neuen Bedingungen gewachsen waren zeigten leider keine Verbesserung in der Auflösung, hatten aber hingegen schärfere Reflexprofile in Beugungsexperimenten und eine niedrigere Mosaizität. In einem weiteren Projekt, sollte der Membranteil zusammen mit den Inhibitoren DCCD (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid), Phloretin und Phloridzin kristallisiert werden. Für DCCD gibt es bereits detaillierte biochemische Informationen, aber noch keine Struktur in kovalent gebundener Form am c-Ring einer Protonen ATP Synthase. Phloridzin ist ein Zuckerderivat von Phloretin. Für beide Substanzen werden inhibitorische Effekte berichtet. Es sind aber nur wenige biochemische Informationen vorhanden und eine Bindungstasche ist nicht bekannt. In einem Datensatz mit einem Co-Kristall aus Phloridzin und dem c-Ring konnte zusätzlich positive Elektronendichte an einer Protonenbindungstasche identifiziert werden. Eine Zuordnung zu Phloridzin war aber wegen der geringen Auflösung von 4.25 Å nicht möglich. ATP synthase from spinach belongs to a group of essential enzymes which produce most of the cell's ATP supply. The energy stored in light is used in photosynthetic active complexes to produce an outward pointing electron/proton gradient across the thylakoid membrane of chloroplasts. This energisation of the membrane is a prerequisite for active FoF1 ATP synthase. ATP synthase pumps protons back across the thylakoid membrane into the chloroplast. During this translocation process, the electrical energy of the gradient is transformed into the mechanical energy of a rotation. This rotation takes place in the membrane part Fo and is translated via a stalk into a membrane associated part F1 which carries the catalytic active sites. Conformational changes in these binding sites result in formation of an anhydride bond between the substrates, ADP and inorganic phosphate, and produces ATP. For F1 a detailed structure is available and also the reaction mechanism in the binding sites is known on the atomic level. In contrast, for Fo a little information is available, and mechanisms as well as structural details are still at the levels of proposals and hypotheses. In this work X-ray crystallography was used to solve the structure for the main part of Fo, namely the proton translocating rotor, to a resolution of 3.8 Å. This is the first structure of the c-ring of a proton pumping ATP synthase and can therefore be used to explain several findings of binding behaviour as well as proposed structural details and mechanism. Crystals produced with new crystallisation conditions had no effect on the resolution. Instead, some of the changes improved the spot quality in diffraction experiments and decreased the mosaicity. Co-crystallisation of the c-ring with the inhibitors DCCD (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), phloretin, and phloridzin was also attempted. For DCCD detailed biochemical information about inhibitory effects is already known. However, a structure of the c-ring of a proton translocating ATP synthase with covalently bound DCCD has not yet been solved. Phloridzin is a sugar derivative of phloretin. For both substances inhibitory effects have been reported but only a little biochemical information is available and no binding site is identified. Data set analysis of a protein-inhibitor crystal with phloridzin showed extra electron density near one proton binding site, but couldn't be identified for definite because of low resolution of 4.25 Å.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	25.05.2010
Dateien geändert am:	11.04.2010
Promotionsantrag am:	07.07.2009
Datum der Promotion:	17.09.2009