Dokument: Vergleichende Phosphoproteomanalyse bei NO-induzierter Herzinsuffizienz

Titel:	Vergleichende Phosphoproteomanalyse bei NO-induzierter Herzinsuffizienz
Weiterer Titel:	Global Cardiac Phosphoproteome Analysis In Nitric Oxide-Induced Heart Failure
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12648
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100412-162512-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Simon, Annamaria [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,27 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.09.2009 / geändert 23.09.2009
Beitragende:	Prof. Dr. med. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Weinkauf, Rainer [Gutachter]
Stichwörter:	nitric oxide, heart failure, protein phosphorylation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Myoglobin ist das wichtigste sauerstoffbindende Hämoprotein des Herzens. Es fungiert als NO-Scavanger und sorgt für eine räumliche Begrenzung der physiologischen und pathophysiologischen Effekte des im Herzen gebildeten NO. Die induzierte Isoform der Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) wird nur unter pathophysiologischen Bedingungen im Myokard exprimiert, wie z.B. bei Ischämie-Reperfusion, Sepsis und bei einer Herzinsuffizienz. Die Zielproteine und Signalwege von NO und deren Rolle bei der Regulation der Herzfunktion sind bislang noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit wurde eine gelfreie Phosphoproteomanalyse etabliert und damit ein NO-induziertes Herzinsuffizienzmodell der Maus analysiert. Zu diesem Zweck wurden transgene Mäuse mit herzspezifischer iNOS Überexpression bei gleichzeitigem Mangel von Myoglobin (iNOS+/myo-/-) verwendet. Die Herzen dieser Tiere wurden isoliert und mit einem salinen Medium perfundiert, welches das NOS-Substrat L-Arginin (200μM) enthielt. Nach Arginin Zugabe nahm die Kontraktionskraft des Herzens um 30% ab und erreichte bereits nach einer Minute stabile hämodynamische Werte. Danach wurden die Herzen schockgefroren und anschließend eine stabile Isotopen Dimethyl-Markierung der verdauten Peptide durchgeführt, welche eine 4 Da große Massendifferenz pro markierter primärer Aminogruppe der Peptid N-Termini und der Lysinreste bewirkt. Diese Massendifferenz war dann die Grundlage für eine quantitative Analyse des Phosphoproteoms mittels Massenspektrometrie. Hierzu wurden die Peptide zunächst über eine starke Kationenaustauschersäule fraktioniert und anschließend erfolgte die Anreicherung der Phosphopeptide über Titaniumdioxidpartikel. Danach wurden die Einzelfraktionen durch nanofluß Umkehrphasen Flüssigkeitschromatographie getrennt und mit Hilfe eines daran gekoppelten Tandem Massenspektrometers analysiert (nanoRP-LC-MS/MS). Insgesamt wurden zwei biologische und zwei technische Replikate gemessen, wobei jeweils die Membran- und die cytosolische Fraktion analysiert wurde (n=8). Mit Hilfe der neu etablierten und validierten analytischen Methoden war es möglich 826 Phosphorylierungsstellen (246 neue Stellen) zu identifizieren, welche sich auf 772 Peptide bzw. auf 475 Proteine verteilen. Die Verteilung der Phosphorylierungstellen im Einzelnen war: 81.2% Serin, 18.2 Threonin und 0.6% Tyrosin. Bei dem iNOS induzierten Herzinsuffizienzmodell wurden 50 Phosphorylierungsstellen gefunden, die herunterreguliert (31 neue) bzw. 69 die hochreguliert waren (16 neue). Hierbei fanden sich wesentliche Proteine der Kalzium-Homöostase (z. B. L-Typ Kalziumkanal, Phospholamban, Ryanodinrezeptor, Sarcalumenin), kardialen Kontraktilität (z.B. Myosin-6, Myosin bindendes Protein C), Energetik (z.B. Pyruvatdehydrogenase, ATP Citrat-Lyase), mitchondrialer Atmung (z.B. NADH Dehydrogenase 1 alpha Unterkomplex Untereinheit 7, ATP Synthase Untereinheit alpha) und der Transkription (z.B. Histon Deacetylase 4, Isoform 2 des Glucocorticoid Rezeptors). Interessanterweise wurde auch der Phosphorylierungsgrad verschiedener Kinasen und Phosphatasen (z.B. Proteinkinase C alpha, MAP Kinase Kinase 4, Protein Phosphatase 2A B56 delta Untereinheit) durch NO direkt beeinflusst. Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass es sich bei dieser Studie um die erste Erfassung des globalen kardialen Phosphoproteoms in einem NO-induzierten Herzinsuffizienzmodell handelt. Die Vielzahl der neu entdeckten Phosphorylierungsstellen machen eine wichtige regulatorische Funktion bei der NO-induzierten Herzinsuffizienz wahrscheinlich. Jedoch muss die Funktionalität dieser neuen Phosphorylierungsstellen in weiterführenden Studien geklärt werden. Myoglobin, the major oxygen binding and transporting heme protein of the heart can act as a nitric oxide (NO) scavenger, compartmentalizing the physiological and pathophysiological effects of produced NO. The inducible isoform of nitric oxide synthase (iNOS) is only expressed during pathophysiological conditions in the myocardium including diseases such as ischemia-reperfusion, septicaemia and heart failure. End-targets and signaling pathways of iNOS-derived NO in the modulation of cardiac function are not fully understood. To perform a global gel-free phosphoproteome analysis in a model of NO-induced heart failure, isolated perfused hearts of transgenic mice with cardiac specific iNOS overexpression on a myoglobin deficient background (iNOS+/myo-/-) were co-perfused either with the NOS substrate L-arginine (200μM) or with saline buffer. After 1 minute L-arginine exposure the contractile force was decreased by 30% to a new steady state, at which point hearts were freeze clamped. For mass spectrometry based quantitative analysis, stable isotope dimethyl labeling of digested peptides was applied which introduced a 4Da mass difference per labelled primary amino group of peptide N-terminus and lysine residues. To reduce sample complexity peptides were fractionated on a strong cation exchange column, followed by phosphopeptide enrichment on titanium dioxide particles. Fractions were further separated and analyzed by nano flow reverse phase liquid chromatography online coupled with a tandem mass spectrometer (nanoRP-LC-MS/MS). In order to obtain reliable results, two biological and two technical replicates were measured of each membrane and cytosolic fraction (n=8). Elaborated technology enabled the identification of 826 phosphorylation sites (246 novel) corresponding to 772 peptides which relate to 475 proteins. Phosphorylation site distribution was 81.2% serine, 18.2% threonine and 0.6% tyrosine. In this model of iNOS-induced heart failure 50 phosphorylation sites were downregulated (31 novel) and 69 were upregulated (16 novel) in proteins involved in calcium homeostasis (e.g. L-type calcium channel, phospholamban, ryanodine receptor, sarcalumenin), cardiac contractility (e.g. myosin-6, myosin binding protein C), energetics (e.g. pyruvate dehydrogenase, ATP citrate lyase) mitochondrial respiration (e.g. NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 7, ATP synthase subunit alpha) and transcription (e.g. histone deacetylase 4, isoform 2 of glucocorticoid receptor). Additionally, kinases and phosphatases (e.g. protein kinase C alpha, MAP kinase kinase 4, protein phosphatase 2A B56 delta subunit) were also regulated upon iNOS derived NO release. In summary, this study provides the first global account of the cardiac phosphoproteome in NO-induced heart failure. Many novel phosphorylation sites were discovered which can be linked to depressed contractility, cardiac energetics and remodeling and are likely to have important novel regulatory functions.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtlichen Gründen bis 31.03.2010 zurückgestelt
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie
Dokument erstellt am:	12.04.2010
Dateien geändert am:	23.09.2009
Promotionsantrag am:	18.06.2009
Datum der Promotion:	16.07.2009