Dokument: NMR-Lösungsstruktur der Loopregion Tyr67 - Leu77 des visuellen Arrestins im Komplex mit photoaktiviertem Rhodopsin

Titel:	NMR-Lösungsstruktur der Loopregion Tyr67 - Leu77 des visuellen Arrestins im Komplex mit photoaktiviertem Rhodopsin
Weiterer Titel:	NMR solution structur of of the loop region Tyr67 - Leu77 of visual arrestin in complex with light activated rhodopsin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12386
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090818-110825-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Feuerstein, Sophie Elise [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.08.2009 / geändert 12.08.2009
Beitragende:	PD. Dr. König, Bernd [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Rhodopsin Arrestin NMR Peptid Signaltransduktion GPCR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Rhodopsin ist das Sehpigment der Stäbchenzellen der Vertebraten und der Prototyp eines G-Protein gekoppelten Rezeptors. Durch die Absorption eines Photons wird Rhodopsin aktiviert und dabei in eine Reihe von Zwischenzuständen umgewandelt. Metarhodopsin II (MetaII) interagiert mit dem G-Protein Transduzin und löst dadurch die Signalkaskade aus. Diese wird beendet, indem Rhodopsin phosphoryliert und anschließend von Arrestin mit hoher Affinität gebunden wird. Ein Modell beschreibt, dass zwei Arrestin-Erkennungsstellen an dieser Bindung beteiligt sind, die sogenannte Aktivierungserkennungsstelle und die Phosphorylierungserkennungsstelle. Bis heute gibt es jedoch noch keine hochaufgelöste Struktur von Transduzin oder Arrestin im Komplex mit lichtaktiviertem Rhodopsin. Das Ziel dieser Arbeit war die Strukturaufklärung eines Transduzin- oder Arrestinpeptids im Rhodopin gebundenen Zustand. Rhodopsin ist in den Diskmembranen der Stäbchenzellen lokalisiert und eignet sich nicht für die Flüssig-NMR-Spektroskopie. Der transferierte Kern- Overhauser-Effekt (TrNOE) und die transferierte Restdipolkopplung (TrRDC), die an der freien Form eines Peptids detektiert werden, enthalten jedoch Informationen über den gebundenen Zustand des Peptids. Voraussetzung dafür ist, dass sich die freie und gebundene Form des Peptids im schnellen Austausch befinden. Eine Reihe synthetischer Peptide wurde auf deren Wechselwirkungsverhalten mit MetaII und deren Eignung für TrNOE/TrRDC-Experimente untersucht. Die Peptide entsprechen bereits identifizierten Bindestellen des G-Proteins Transduzin und des regulatorischen Proteins Arrestin, welche beide während der visuellen Signaltransduktion an MetaII binden. Die Region des Loops zwischen den b-Strängen V und VI des Arrestins wird zur Zeit als Teil der Aktivierungserkennungsstelle diskutiert. Basierend auf den ermittelten TrNOE- und TrRDC-Daten konnte gezeigt werden, dass Peptide, die der Aminosäuresequenz dieser Loopregion entsprechen, an aktiviertes, unphosphoryliertes Rhodopsin binden. Abstände zwischen Protonen, die über TrNOE ermittelt wurden, charakterisieren die Struktur des rezeptorgebundenen Peptids und wurden als struktureinschränkende Parameter für die Strukturberechnung des Arr(67-77)-Peptids durch in Xplor-NIH implementierte Moleküldynamik- Protokolle verwendet. Zusätzlich zeigten die TrRDC-Messungen des [U-15N]-angereicherten Arr(67-77), dass das Peptid sich für die Bestimmung der Orientierung im Rhodopsin gebundenen Zustand eignet, denn die 1JNH-Aufspaltungen, die direkt nach der Photoaktivierung gemessen wurden, zeigten den erwarteten zeitabhängigen exponentiellen Verlauf. Es konnte das erste Mal die Struktur eines Arrestin-Peptids im Rhodopsin gebundenen Zustand mittels TrNOE gelöst werden. Das Peptid Arr(67-77) entspricht der Loopregion zwischen den b-Strängen V und VI des Arrestins. In der Kristallstruktur des inaktiven Arrestins ist diese Region unstrukturiert und möglicherweise flexibel. Die Bindung an photoaktiviertes Rhodopsin induziert eine a-helikale Struktur zwischen den Aminosäuren E70 bis M75. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann geschlußfolgert werden, dass Arr(67-77) höchstwahrscheinlich Teil der Aktivierungserkennungsstelle beim Mechanismus der Arrestin-Rhodopsin- Bindung ist. Rhodopsin, the visual pigment of rod outer segments of vertebrate photoreceptor cells, is the prototype of a G-protein coupled receptor (GPCR). Absorption of a single photon activates rhodopsin, which converts to a series of photointermediates. Metarhodopsin II (metaII) interacts with the G-protein transducin, thereby initiating the signaling cascade. The termination of the light response is accomplished by the phosphorylation of rhodopsin and the subsequent tight binding of arrestin to phosphorylated metaII. A sequential multi-site binding model for arrestin implicates engagement of two arrestin sites, the activation and the phosphorylation recognition sensor. Until now, there is no high resolution structure of transducin or arrestin in complex with light activated rhodopsin. The aim of this work was the structure determination of a tranducin or arrestin derived peptide in the rhodopsin bound state. Membrane embedded rhodopsin is not suitable for observation by liquid state NMR. However, transferred nuclear Overhauser effect (TrNOE) and transferred residual dipolar couplings (TrRDC) recorded on the free form of a peptide report on the membrane protein bound peptide conformation provided that there is sufficiently fast exchange between free and bound peptide. A library of synthetic peptides was screened for candidates that bind to metaII with an affinity that is in the range most suitable for TrNOE/TrRDC experiments. The peptides mimic previously identified binding regions from the G-protein transducin and the regulatory protein arrestin which interact with metaII in visual signal transduction. The loop region between b-strands V and VI of arrestin is currently discussed as part of the activation recognition site. TrNOE and TrRDC data showed that peptides which correspond to this loop region transiently bind to activated, unphosphorylated rhodopsin. TrNOE-derived proton-proton distances characterising the receptor-bound peptide were used as restraints in molecular dynamics-based simulated annealing protocols implemented in Xplor- NIH for structure calculation of the arrestin derived peptide Arr(67-77). Additionally, TrRDC data of uniformly 15N-labeled Arr(67-77) showed that the peptide seems to be appropriate for orientation determination, since 1JNH splittings measured directly after light activation showed the expected time dependent exponential decay. It was possible to solve the structure of an arrestin peptide in the receptor bound state by TrNOE data for the first time. The peptide Arr(67-77) reflects the loop region between b- strands V and VI of the parent arrestin molecule. In the crystal structure of inactive arrestin Rhodopsin, the visual pigment of rod outer segments of vertebrate photoreceptor cells, is the prototype of a G-protein coupled receptor (GPCR). Absorption of a single photon activates rhodopsin, which converts to a series of photointermediates. Metarhodopsin II (metaII) interacts with the G-protein transducin, thereby initiating the signaling cascade. The termination of the light response is accomplished by the phosphorylation of rhodopsin and the subsequent tight binding of arrestin to phosphorylated metaII. A sequential multi-site binding model for arrestin implicates engagement of two arrestin sites, the activation and the phosphorylation recognition sensor. Until now, there is no high resolution structure of transducin or arrestin in complex with light activated rhodopsin. The aim of this work was the structure determination of a tranducin or arrestin derived peptide in the rhodopsin bound state. Membrane embedded rhodopsin is not suitable for observation by liquid state NMR. However, transferred nuclear Overhauser effect (TrNOE) and transferred residual dipolar couplings (TrRDC) recorded on the free form of a peptide report on the membrane protein bound peptide conformation provided that there is sufficiently fast exchange between free and bound peptide. A library of synthetic peptides was screened for candidates that bind to metaII with an affinity that is in the range most suitable for TrNOE/TrRDC experiments. The peptides mimic previously identified binding regions from the G-protein transducin and the regulatory protein arrestin which interact with metaII in visual signal transduction. The loop region between b-strands V and VI of arrestin is currently discussed as part of the activation recognition site. TrNOE and TrRDC data showed that peptides which correspond to this loop region transiently bind to activated, unphosphorylated rhodopsin. TrNOE-derived proton-proton distances characterising the receptor-bound peptide were used as restraints in molecular dynamics-based simulated annealing protocols implemented in Xplor- NIH for structure calculation of the arrestin derived peptide Arr(67-77). Additionally, TrRDC data of uniformly 15N-labeled Arr(67-77) showed that the peptide seems to be appropriate for orientation determination, since 1JNH splittings measured directly after light activation showed the expected time dependent exponential decay. It was possible to solve the structure of an arrestin peptide in the receptor bound state by TrNOE data for the first time. The peptide Arr(67-77) reflects the loop region between b- strands V and VI of the parent arrestin molecule. In the crystal structure of inactive arrestin this region is unstructured and perhaps flexible. Binding to light activated rhodopsin induces an a-helical structure between residues E70 und M75. The presented data indicate that Arr(67-77) most probably is part of the activation recognition sensor in the multi-site mechanism of arrestin-rhodopsin-binding.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » NMR - Spektroskopie biologischer Makromoleküle
Dokument erstellt am:	18.08.2009
Dateien geändert am:	12.08.2009
Promotionsantrag am:	09.12.2008
Datum der Promotion:	21.01.2009