Dokument: Untersuchungen verschiedener Stufen der CD95-vermittelten Apoptose und des IAP Survivin in Vorläufer-B-Zell-Leukämieblasten von Kindern

Titel:	Untersuchungen verschiedener Stufen der CD95-vermittelten Apoptose und des IAP Survivin in Vorläufer-B-Zell-Leukämieblasten von Kindern
Weiterer Titel:	Different steps of CD95-mediated apoptosis in pediatric precursor b-cell leukemias
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12382
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090813-091308-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Siepermann, Meinolf [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.08.2009 / geändert 12.08.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Dilloo, Dagmar [Gutachter] Prof. Dr. Gattermann, Norbert [Gutachter]
Stichwörter:	Vorläufer-B-Zell-Leukämie bei Kindern, Apoptose, c-FLIP, Survivin
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Maligne transformierte Zellen haben Resistenzmechanismen entwickelt, um sich der physiologischen Apoptose und damit ihrer immunologischen Elimination zu entziehen. Auch in den unreifen B-Zell-Blasten der akuten lymphatischen Leukämie von Kindern scheint eine Apoptoseresistenz entscheidend zur Entwicklung einer hochmalignen und aggressiv schnell proliferierenden Erkrankung beizutragen. Schwerpunkt dieser Arbeit war es, einzelne rezeptornahe und an der Endstrecke der Apoptosekaskade beteiligte Moleküle, die zur pathologischen Regulation der Todesrezeptor-CD95-vermittelten Apoptose führen zu untersuchen und die Unterschiede zu normalen B-Zellen zu beschreiben. Zu den im Western Blot untersuchten Molekülen gehörten insbesondere die an der Bildung des Todesrezeptorkomplex (DISC, „death-inducing-signaling-complex“) beteiligten Vertreter. Das Molekül c-FLIP, welches die Aktivierung der Procaspase-8 am DISC blockiert und dadurch die Fortleitung der durch CD95 eingeleiteten Apoptosekaskade in den frühen Schritten verhindert, war Schwerpunkt der Untersuchung. In den beiden unreifen Lymphomzelllinien Daudi und Raji zeigte sich nach CD40-Stimulation eine hohe CD95-Expression, dennoch lag in beiden Zelllinien eine Resistenz für CD95-vermittelte Apoptose vor. Ursächlich scheint bei CD40-stimulierten Daudi-Zellen eine überproportional stärkere Hochregulation des antiapoptotischen Proteins c-FLIP short zu sein. In den Raji-Zellen wurde durch Zugabe des Proteinsynthesehemmer Cycloheximid, das zuvor ausgeglichene Verhältnis zwischen FLIP long und –R, zugunsten der proapoptotischen FLIP long Form verschoben, und eine deutliche Sensitivierung für CD95-vermittelte Apoptose erreicht. In den primären Vorläufer-B-ALL-Blasten zeigte sich nach CD40-Stimulation eine Hochregulation der beiden antiapoptotischen kurzen Isoformen FLIP short und –R, wobei die Expression von FLIP-R erstmalig in kindlichen Vorläufer-B-ALL-Blasten nachgewiesen wurde. In den gesunden reifen B-Zellen die eine signifikant höhere Sensitivität für CD95-vermittelte Apoptose zeigten, wurde die proapoptotisch wirksame long-Form deutlich stärker als die antiapoptotische FLIP short-Isoform exprimiert. Die kurze Isoform FLIP-R war in den normalen B-Zellen, nicht nachweisbar. Es konnte erstmalig eine Überexpression der kurzen FLIP-Isoformen (short und –R) als eine Ursache für die gesteigerte Apoptoseresistenz der Vorläufer-B-ALL-Blasten von Kindern, gegenüber CD95-vermittelter Apoptose, im Vergleich zu gesunden B-Zellen belegt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das antiapoptotische Molekül Survivin, ein Mitglied der „Inhibitor of apoptosis family“ (IAP) auf Protein- sowie mRNA-Ebene in Vorläufer-B-ALL-Blasten von Kindern quantifiziert und seine prognostische Bedeutung geprüft. Das tumorspezifische Molekül Survivin hemmt die gemeinsame Endstrecke des todesrezeptor-vermittelten und des über die Mitochondrien fortgeleiteten Apoptosepathways, durch Inhibition der Effektorcaspasen-3 und –9. Die Messung der Survivin Gesamt-Proteinkonzentration erfolgte mittels ELISA-Technik in Vorläufer-B-ALL-Blasten von 66 Kindern. In einer retrospektiven multivariaten Analyse stellt sich Survivin als ein neuer unabhängiger Risikoparameter von den klassischen klinischen Risikofaktoren (Alter, Leukozytenzahl, Immunphänotyp, PVA-Score, Translokationen) dar. Die erhöhte Survivin-Expression konnte als unabhängiger Risikofaktor für das 3-Jahre-ereignisfreie-Überleben, das 3-Jahre-rezidivfreie-Überleben und das Gesamtüberleben identifiziert werden. Auf mRNA-Ebene erfolgte die Analyse der Expression von Survivin und seinen funktionell bedeutsamen Splicevarianten Survivin-2B und Survivin-ΔExon3 in einer qualitativen und quantitativen PCR. Survivin wurde in den Vorläufer-B-ALL-Blasten der untersuchten Kinder deutlich überexprimiert und die Höhe der relativen mRNA-Expression von Survivin und seinen Splicevarianten anschließend mit den klassischen klinischen Risikofaktoren korreliert. Es konnte eine signifikant höhere Expression der pro-apoptotischen Splicevariante Survivin-2B bei den Niedrigrisikopatienten im Vergleich zu den Hochrisikopatienten nachgewiesen werden und somit die prognostisch und eventuell therapeutische Relevanz gezeigt werden. Previous studies on apoptosis defects in acute lymphoblastic leukemia (ALL) have focused on chemotherapy-induced, primarily mitochondrial death pathways. Yet, immunologic surveillance mechanisms including sensitization to apoptotic signals mediated via the death receptor CD95 might contribute to leukemic control. Here, we show that primary B-cell precursor ALL cells from children escape from receptor-dependent cell death in 2 ways: Resting ALL blasts are protected from receptor-mediated apoptosis due to the absence of CD95 surface expression. However, even though CD40 ligation results in up-regulation of CD95, ALL blasts,unlike normal B cells, remain resistant to apoptosis. We show that this apoptosis resistance involves the selective up-regulation of the short isoforms of the caspase-8 inhibitor c-FLIP acting directly at the CD95 receptor level. Treatment with cycloheximide during CD40 activation prevents up-regulation of those c-FLIP isoforms and sensitizes ALL cells toward CD95-mediated apoptosis. We therefore propose that induction of the short c-FLIP isoforms inhibits the onset of CD95-induced apoptosis in primary CD40-stimulated ALL cells despite high CD95 expression. Impaired apoptosis, mediated by members of the inhibitor of apoptosis proteins (IAP) family such as survivin, is thought to contribute to leukemic cell survival. In contrast to low expression of survivin protein in normal differentiated adult tissues, very high levels of survivin protein have been described in a number of different tumors. Overexpression of survivin was found to correlate with poor prognosis in a variety of cancers including hematologic malignancies. To date, however, there is no information available on the prognostic role of survivin in pediatric precursor B-cell acute lymphocytic leukemia (BCP-ALL), the most frequent malignancy in childhood. In a retrospective study including 66 pediatric patients we analyzed the impact of survivin protein levels on outcome in BCP-ALL. RESULTS: Survivin overexpression, with an up to ten-fold increase of the normal level, was detected in 65% of the leukemic samples in contrast to negligible expression in non-malignant hematopoietic cells. Despite considerable variety of expression levels in ALL cells, there was no association of survivin levels with established risk factors. However, patients suffering relapse of disease or death had significantly higher survivin expression than those with a favorable outcome. Overexpression of survivin is a significant prognostic marker for 3 year relapse free, event-free and overall survival, again independent of the established prognostic factors in ALL, such as age and leukocyte count at diagnosis as assessed in multivariate analysis. Overexpression of survivin in BCP-ALL identifies patients with a high risk of early relapse. Upon confirmation in a prospective analysis, survivin expression may, in the future, serve to further refine treatment stratification with intensification of therapy in those patients prone to relapse. Survivin protein is transiently expressed at low levels during normal hematopoesis but profoundly overexpressed in adult leukemia potentially contributing to leukemogenesis due to deregulated apoptosis and defective cell cycle control. Alternative splicing results in four different mRNA variants survivin, survivin2B, survivin-DeltaExon3 and survivin-3B, with distinct cellular localization patterns and anti-apoptotic potential. Due to co-localization of survivin and survivin-2B in the cytoplasm survivin-2B may permit interactive fine-tuning of survivin actions and moreover play an attenuating role in its anti-apoptotic function. Lack of survivin-2B is associated with disease progression of malignomas suggesting a differential role of these isoforms in tumorigenesis. We therefore determined the expression of the functional survivin splice variants performing RT- and real-time PCR in a purely pediatric cohort of 20 patients suffering from precursor B-ALL (BCP-ALL). Here, we demonstrate for the first time in pediatric patients with precursor B-ALL an association between lower survivin-2B expression and affiliation to the high risk group. The idea that survivin-2B may act as natural antagonist of survivin could potentially be used in novel approaches of anti-cancer treatment by influencing the proportional expression of the different splice variants.
Quelle:	Troeger, A., Siepermann, M., Escherich,G., Meisel, R., Willers, R., Gudowius, S., Laws, HJ., Hanenberg, H., Göbel, U., Janka-Schaub, G., Mahotka, C., Dilloo, D., Survivin and its prognostic significance in acute B cell precursor lymphoblastic leukemia, Haematologica 2007 Aug;92(8):1043-50 Troeger, A., Siepermann, M., Mahotka, C., Wethkamp, N., Bülle, H., Laws, HJ., Escherich, G., Janka-Schaub, G., Göbel, U., Dilloo, D., Role of Survivin splice variants in pediatric acute precursor B lymphoblastic leukemia, Klin Padiatr. 2007 May-Jun;219(3):127-33 Troeger, A., Schmitz, I., Siepermann, M., Glouchkova, L., Gerdemann, U., Janka-Schaub, G. E., Schulze-Osthoff, K., Dilloo, D., Upregulation of c-FLIPS+R upon CD40-Stimulation is associated with inhibition of CD95-induced apoptosis in primary precursor B-ALL, Blood. 2007 Jul 1;110(1):384-7
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	2002-2009
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	13.08.2009
Dateien geändert am:	12.08.2009
Promotionsantrag am:	25.01.0009
Datum der Promotion:	11.08.2009