Dokument: On the ultrafast kinetics of the energy and electron transfer reactions in Photosystem I

Titel:On the ultrafast kinetics of the energy and electron transfer reactions in Photosystem I
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20090917-101217-7
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor:DR. Slavov, Chavdar [Autor]
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Dateien vom 04.08.2009 / geändert 04.08.2009
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:Die Photosynthese stellt den primären Prozess zur Bereitstellung von Energie für die biologische Welt dar. In ihrem Verlauf wird die Lichtenergie durch komplexe Einheiten hocheffizient umgewandelt. Allgemein ausgedrückt besteht dieser Prozess aus zwei Teilen: dem lichtabhängigen Teil und der Kohlenstofffixierung. Der lichtabhängige Teil umfasst Reaktionen, die zur Umwandlung von Licht in chemische Energie (ATP) und zur Reduktion (NADPH) notwendig sind, während die Kohlenstofffixierung letztgenannte Komponenten zur Verbindung von CO2 in einfache Zucker verwendet. Der Großteil photosynthetischer Organismen verwendet in diesem als oxygene Photosynthese bezeichneten Prozess hauptsächlich Wasser als Elektronenquelle.
Die Bedeutung und Komplexität der Photosynthese sind Bestandteil systematischer Forschung: beginnend von der Untersuchung der rein molekularen Mechanismen bis hin zur Betrachtung physiologischer und ökologischer Aspekte. Die Ergebnisse dieser Studien finden in Gebieten wie beispielsweise Agronomie und Umweltschutz breite Anwendung. Bezüglich der globalen Erwärmung sowie der Energiekrise, mit der die Menschheit konfrontiert ist, wird weiterhin das tiefere Verständnis der Photosynthese entscheidend sein: einerseits zur Erhaltung der empfindlichen Ökosysteme, andererseits zur Vermeidung eines Zusammenbruchs der Weltwirtschaft. In diesem Zusammenhang beschäftigt sich ein großes Gebiet der Photosyntheseforschung mit der Entwicklung ökologischer Umwandlungssysteme von Lichtenergie zur künstlichen Nachahmung des photosynthetischen Apparates.
Um hierbei die funktionellen Ansätze der Natur genau verstehen zu können, müssen die Mechanismen jedes einzelnen Teils des photosynthetischen Apparates detailliert untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit steht das Photosystem I (PS I), das Hauptbestandteil des lichtabhängigen Teils der oxygenen Photosynthese ist, im Mittelpunkt. Dieser Komplex besitzt eine beträchtliche Anzahl an Kofaktoren: Chlorophylle (Chl), Carotenoide, Chinone etc., welche in Verbindung mit der Proteineinheit einige außergewöhnliche Eigenschaften aufweisen. Charakteristisch für das PS I ist erstens eine ultraschnelle Kinetik des Lichteinfangs mit einer Quantenausbeute von nahezu 100%. Zweitens wird vermutet dass beide der Elektronentransferzweige im Reaktionszentrum aktiv sind. Drittens existieren im PS I - Antennensystem einige sogenannte ′rote′ Chls, die bei längeren Wellenlängen als das Reaktionszentrum absorbieren. Diese ′roten′ Chls modifizieren die Kinetiken des Lichteinfangs in PS I beträchtlich.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist das bessere Verständnis der oben erwähnten, besonderen Eigenschaften des PS I. Diese Untersuchungen werden nicht nur zum besseren Verständnis des Energie- und Elektronentransfers im PS I-Komplex beitragen, sondern auch zur zukünftigen Entwicklung von optimierten Lichtsammelkomplexen. In dieser Arbeit werden eine Reihe von PS I-Komplexen, die aus verschiedenen Organismen (Thermosynechococcus elongatus, Chlamydomonas reinhardtii, Arabidopsis thaliana) isoliert wurden und unterschiedliche Eigenschaften aufweisen (unterschiedliche Makroorganisation – Monomere, Trimere, und Monomere mit einen 'semibelt' von peripheren Antennen; Besitz von 'roten' Chls), untersucht. Der Schwerpunkt liegt auf den Kinetiken des Elektronentransfers in beiden Kofaktorästen im PS I Reaktionszentrum, sowie auf dem Effekt der Antennengrösse und den ‘roten’ Chls auf die Kinetiken des Lichteinfangs im PS I. Diese Aspekte wurden mittels mehrerer ultraschneller optischer Methoden erforscht: i) zeitaufgelöster Fluoreszenz – Single Photon Counting und Synchroscan Streak Kamera und ii) ultraschneller transienter Absorption. Physikalisch bedeutsame Informationen zum molekularen Mechanismus der Energiesammlung im PS I werden mit Hilfe der kinetischen Modellierung gewonnen.
Kapitel 1 liefert eine breitgefächerte Einführung in die Hauptgebiete der Kinetik des Lichteinfangs (insbesondere von PS I), welche noch aufzuklären sind.
Kapitel 2 fasst die experimentellen Techniken und Methoden der Datenanalyse, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, zusammen.
Kapitel 3 beschreibt detailliert eine der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Methode zur zeitaufgelösten Detektion von Fluoreszenzsignalen: die Synchroscan Streak-Kamera. In diesem Kapitel werden sowohl die Tests, die während des Aufbaus dieses Systems durchgeführt wurden, als auch die Verbesserungen, die im Rahmen dieser Arbeit zur Erzielung qualitativ hochwertiger Daten realisiert wurden, beschrieben.
In Kapitel 4 wird die Lichteinfangkinetik von Kernkomplexen und intakten PS I - Komplexen sowie der Stroma-Membran von A. thaliana detailliert untersucht. Die kinetische Analyse der experimentellen Daten bestätigt das zuvor vorgeschlagene ′Ladungsrekombinations′-Modell für die Einfangkinetik von PS I. Im Energiefluss von den Antenneneinheiten zum Reaktionszentrum wurde kein Engpass beobachtet. In beiden Komplexen liegt eine ′trap′-limitierte Kinetik mit einer Ladungstrennungslebensdauer von etwa 6 ps vor. Im PS I-Kernkomplex von A. thaliana wurden keine ′roten′ Chls gefunden. Vielmehr stammt die beobachtete rotverschobene Fluoreszenz (700-710 nm Bereich) aus dem Reaktionszentrum. Im Gegensatz hierzu wurden in den intakten PS I - Teilchen zwei ′rote′ Chl - Einheiten, die in den peripheren Lichtsammelkomplexen lokalisiert sind, aufgelöst (mit Zerfallslebensdauern von 33 bzw. 95 ps). Diese zwei ′roten′ Zustände wurden zurückgeführt auf die zwei in Lhca 3 bzw. Lhca 4 gefundenen ′roten′ Zustände. Der Einfluss der ′roten′ Chls auf die Verlangsamung der Gesamt-Einfangkinetik im intakten PS I-Komplex ist schätzungsweise viermal größer als der Effekt der Antennenvergrößerung.
Kapitel 5 stellt eine Studie über die Lichteinfangkinetik in cyanobakteriellen PS I-Komplexen dar: betrachtet werden aus T. elongatus isolierte Monomere sowie Trimere, wobei hierbei denselben Fragestellungen wie im vorherigen Kapitel nachgegangen wird. Es wird gezeigt, dass das "Ladungsrekombinations"-Modell zur Beschreibung der Einfangkinetiken gültig ist. Auf der Grundlage dieses Modells konnte der angeregte Zustand des Reaktionszentrums aufgelöst werden. Es wird gezeigt, dass die Gesamt-Einfangkinetik im untersuchten Komplex trap-limitiert ist, obwohl die Gegenwart der ′roten′ Chls eine beträchtliche Verlangsamung (~60%) verursachen. Zwei sich kinetisch unterscheidende ′rote′ Chl-Einheiten wurden aufgelöst. Beide dieser ′roten′ Einheiten stammen von derselben Pigmentgruppe in einem der zwei Aggregationszuständen. Dies zeigt, dass die ′roten′ Chls durch eine sorgfältige Trennung der Trimere in Monomere nicht beträchtlich beeinflusst werden. Weiterhin kann ihre Position an der Monomer-Monomer Schnittstelle ausgeschlossen werden. In den untersuchten Komplexen wurde ein im Vergleich zu mesophilen PS I - Organismen beschleunigter sekundärer Elektronentransferschritt beobachtet.
Kapitel 6 stellt eine subpikosekunden zeitaufgelöste Fluoreszenzstudie an intakten ′his-tagged′ PS I-Kernkomplexen, isoliert aus C. reinhardtii, dar. Die höhere Zeitauflösung des verwendeten experimentellen Aufbaus (<1 ps) gegenüber früheren Studien ermöglicht die Untersuchung der Anregungsenergieübertragung innerhalb der Antenne. Um diese Prozesse zu berücksichtigen, wurde ein neues verzweigtes Modell mit zwei sequentiell verbundenen Antenneneinheiten in jedem Zweig verwendet. Das Modell beschreibt erfolgreich die experimentellen Daten und liefert wertvolle Informationen über die spektralen Eigenschaften der unterschiedlichen PS I - Kernantenneneinheiten. Außerdem bestätigt die Datenanalyse weiterhin das zuvor vorgeschlagene ′Ladungsrekombinations′-Modell zur Beschreibung der Kinetiken des Lichteinfangs in PS I.
Kapitel 7 behandelt die Verzweigung der Elektronentransferreaktionen im PS I - Reaktionszentrum. Das Reaktionszentrum ist aus zwei Kofaktorzweigen zusammengesetzt, die über eine Pseudo-C2-Symmetrieachse miteinander in Verbindung stehen. Der endgültige Elektronendonor P700 (ein Chlorophyll-Paar) und der tertiäre Akzeptor FX (FeS-Cluster) befinden sich beide auf dieser Achse, während jeder der zwei Zweige aus einem Chlorophyll-Paar (ec2 und ec3) sowie einem Phyllochinon besteht. Basierend auf der Grundlage der beobachteten zweiphasigen Reduktion von FX wurde vorgeschlagen, dass beide Zweige in PS I zur Elektronenübertragung fähig sind, wobei die Natur und die Raten der ersten Elektronentransferschritte noch nicht charakterisiert worden sind. Dieser Teil der vorliegenden Arbeit stellt eine Ultrakurzzeit-Absorptionsstudie an PS I von C. reinhardtii Mutanten vor, in denen spezifische Aminosäuren, die entweder mit ec3A (PsaA-Y696F) oder ec3B (PsaB-Y676F) Wasserstoffbrücken eingehen, vertauscht sind. Die Analyse der experimentellen Daten zeigt, dass die Rate der primären Ladungstrennung unabhängig voneinander in jedem der mutierten PS I Komplexen verringert wird. Dies liefert den direkten Beweis dafür, dass der primäre Elektronentransfer separat und unabhängig voneinander in jedem Zweig initiiert wird. Weiterhin bestätigen die Daten, dass die ersten Ladungstrennungsschritte innerhalb der ec2/ec3 Paare auftreten. Diese bilden ec2+ ec3– Radikalpaare gefolgt von einer schnellen Reduktion von ec2+ durch P700. Die Ergebnisse dieser Studie sind von großer praktischer Bedeutung, da sie die von der Natur in großen Antennensystemen realisierte Lichteinfangkinetiken verdeutlichen.

Photosynthesis is the primary process by which energy is fed into the biological world. In its course, complex machinery performs highly effective transformation of light energy. Quite generally, the process consists of two parts: light-dependent, including the reactions necessary for the conversion of light into chemical energy (ATP) and reducing power (NADPH), and carbon-fixation, where the latter compounds are used to incorporate CO2 into simple sugars. The major part of the photosynthetic organisms utilizes water as a main electron source in a process called oxygenic Photosynthesis.
The significance and complexity of photosynthesis have been a matter of systematic research from the pure molecular mechanisms up to the physiological and even ecological aspects. The results from these studies find extensive application in fields like agronomy and environmental protection. Moreover, in the light of the global warming and the energy crisis faced by humanity, the detailed understanding of photosynthesis becomes crucial not only for the preservation of the vulnerable ecosystems, but also for the prevention of the world economy collapse. In this respect, a large field related to photosynthesis research deals with the design and development of eco-friendly light energy conversion systems mimicking the photosynthetic apparatus.
In order to precisely understand Nature’s engineering approaches the working mechanism of each part of the photosynthetic apparatus has to be studied in detail. In this regard, the subject of the current work is one of the main participants in the light-dependent phase of oxygenic photosynthesis, Photosystem I (PS I). This complex carries an immense number of cofactors: chlorophylls (Chl), carotenoids, quinones, etc, which together with the protein entity exhibit several exceptional properties. First, PS I has an ultrafast light energy trapping kinetics with a nearly 100% quantum efficiency. Secondly, both of the electron transfer branches in the reaction center are suggested to be active. Thirdly, there are some so called 'red' Chls in the antenna system of PS I, absorbing light with longer wavelengths than the reaction center. These 'red' Chls significantly modify the trapping kinetics of PS I.
The purpose of this thesis is to obtain better understanding of the above-mentioned, specific features of PS I. This will not merely cast more light on the mechanisms of energy and electron transfer in the complex, but also will contribute to the future developments of optimized artificial light-harvesting systems. In the current work, a number of PS I complexes isolated from different organisms (Thermosynechococcus elongatus, Chlamydomonas reinhardtii, Arabidopsis thaliana) and possessing distinctive features (different macroorganisation – monomers, trimers, monomers with a semibelt of peripheral antenna attached; presence of 'red' Chls) is investigated. The studies are primarily focused on the electron transfer kinetics in each of the cofactor branches in the PS I reaction center, as well as on the effect of the antenna size and the presence of 'red' Chls on the trapping kinetics of PS I. These aspects are explored with the help of several ultrafast optical spectroscopy methods: i) time-resolved fluorescence – single photon counting and synchroscan streak camera; and ii) ultrafast transient absorption. Physically meaningful information about the molecular mechanisms of the energy trapping in PS I is gained with the help of kinetic modeling.
Chapter 1 is a broad background introduction to the major issues in the light energy trapping kinetics (in particular of PS I) that still remain to be elucidated.
Chapter 2 summarizes the main experimental techniques and data analysis strategies used in the current work.
Chapter 3 represents a broad description of one of the methods used here – synchroscan streak camera – for time-resolved detection of fluorescence signals. The chapter covers the main tests that were performed during the installation of the set-up and improvements that were made during this work in order to obtain high quality data with.
Chapter 4 is a thorough investigation of the light energy trapping kinetics in higher plant core and intact PS I particles, and stroma membranes from A thaliana. The kinetic analysis of the experimental data confirms the previously proposed 'charge recombination' model for the trapping kinetics in PS I. No bottleneck in the energy flow from the bulk antenna compartments to the reaction center has been found. For both particles, a trap-limited kinetics is realized, with an apparent charge separation lifetime of about 6 ps. No 'red' Chls are found in the PS I-core complex from A. thaliana. Rather, the observed 'red'-shifted fluorescence (700-710 nm range) originates from the reaction center. In contrast, two 'red' Chls compartments, located in the peripheral light-harvesting complexes, are resolved in the intact PS I particles (decay lifetimes 33 and 95 ps, respectively). These two 'red' states have been attributed to the two 'red' states found in Lhca 3 and Lhca 4 respectively. The influence of the 'red' Chls on the slowing of the overall trapping kinetics in the intact PS I complex is estimated to be approximately four times larger than the effect of the bulk antenna enlargement.
Chapter 5 is a study of the light energy trapping kinetics in cyanobacterial PS I complexes – monomers and trimers isolated from T. elongatus, addressing the same questions as in the previous chapter. It demonstrates the adequacy of the 'charge recombination' model for describing the trapping kinetics. Based on this model the reaction center excited state can be resolved. The overall trapping kinetics in the studied complex is shown to be trap-limited even though the presence of the 'red' Chls induces a substantial slowing down (~60%). Two kinetically different 'red' Chl pools were resolved. Both of these 'red' pools originate from the same groups of pigments in either of the two aggregation states. This indicates that careful separation of the trimers into monomers does not disturb substantially the 'red' Chls and we can thus exclude their location at the monomer-monomer interface. Acceleration of the secondary electron transfer step in the studied complexes as compared to PS I from mesophilic organisms is observed.
Chapter 6 represents a sub-ps time-resolved fluorescence study performed on His-tagged intact PS I core complexes isolated from C. reinhardtii. The higher time-resolution of the experimental set-up used (<1 ps) allows indebt investigation of the intra-antenna excitation energy transfer. In order to account for these processes a new, branched model with two sequentially linked antenna compartments in each branch was used. The model successfully describes the experimental data and delivers valuable information about the spectral properties of the different PS I antenna pools. In addition, the data analysis further confirms the previously proposed ′charge recombination′ model for the description of the trapping kinetics in PS I.
Chapter 7 deals with the branching of the electron transfer reactions in the RC of PS I. The RC is composed of two cofactor branches related by a pseudo-C2 symmetry axis. The ultimate electron donor P700 (a pair of chlorophylls) and the tertiary acceptor FX (FeS cluster), are both located on this axis, while each of the two branches is made up of a pair of chlorophylls (ec2 and ec3) and a phylloquinone. Based on the observed biphasic reduction of FX it has been suggested that both branches in PS I are competent in electron transfer but the nature and rates of the initial electron transfer steps has not been characterized. This part of the current work reports an ultrafast transient absorption study of C. reinhardtii mutants in which specific amino acids forming H-bonds with either ec3A (PsaA-Y696F) or ec3B (PsaB-Y676F) are exchanged. The analysis of the experimental data shows that the rate of primary CS is lowered independently in each of the mutant PS I complexes, providing direct evidence that the primary ET is initiated separately and independently in each branch. Furthermore, the data prove that the initial CS events occur within the ec2/ec3 pairs, generating ec2+-ec3– radical pairs, followed by rapid reduction by P700. The results on this study are of great practical importance since they reveal the solution used by Nature to optimize the light trapping kinetics from large antenna systems.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:17.09.2009
Dateien geändert am:04.08.2009
Promotionsantrag am:18.05.2009
Datum der Promotion:09.07.2009
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